Ca²⁺是生命體進(jìn)行生理活動(dòng)必不可少的重要金屬離子，其濃度和分布對(duì)于維持細(xì)胞膜兩側(cè)的生物電位,、正常的神經(jīng)傳導(dǎo)功能、正常的肌肉伸縮與舒張功能以及一些激素的調(diào)節(jié)作用是至關(guān)重要的,。而作為細(xì)胞內(nèi)重要的鈣庫,，線粒體的鈣含量比細(xì)胞質(zhì)中的鈣含量高出近千倍,，并且具有十分完善的Ca²⁺攝取和釋放系統(tǒng)。加之線粒體是細(xì)胞能量代謝的中心，其內(nèi)的Ca²⁺參與許多疾病的病理過程,，如缺血性腦損傷,、老年癡呆,、帕金森綜合癥、Ⅱ型糖尿病,、癲癇等,，因此在亞細(xì)胞水平測(cè)定線粒體內(nèi)Ca²⁺的濃度和分布情況,，不僅可以幫助我們更好地理解機(jī)體內(nèi)Ca²⁺信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),，還可以幫助科研工作者系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)Ca²⁺在生理,、病理過程中發(fā)揮的作用,。

圖1. 鈣離子探針的合成路徑

（圖片來源：Angew.Chem. Int. Ed.）

近日,，意大利帕多瓦大學(xué)Diana Pendin博士和Andrea Mattarei博士聯(lián)手報(bào)道了一種可以定位于線粒體的熒光探針,，該探針在結(jié)合鈣離子前后其紫外吸收,、熒光激發(fā)及發(fā)射圖譜都會(huì)發(fā)生明顯的變化,，基于這種特性，作者將其作為鈣離子探針對(duì)活細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子的分布進(jìn)行了成像,。該成果以“A Synthetic Fluorescent Mitochondria-Targeted Sensor for Ratiometric Imaging of Calcium in Live Cells”為題發(fā)表于《德國應(yīng)用化學(xué)》（DOI: 10.1002/anie.201902272）。

鈣離子探針的合成總體上分為四步：鈣離子識(shí)別母體合成-熒光團(tuán)的修飾-定位基團(tuán)的修飾-細(xì)胞穿透輔助基團(tuán)AM的修飾,。首先作者以對(duì)苯二酚為原料通過10步反應(yīng)制備了含鈣離子螯合結(jié)構(gòu)BAPTA的衍生物A10,，該衍生物在BAPTA的基礎(chǔ)上引入了4-氯丁基以便與三苯基膦反應(yīng)；之后,，通過三步反應(yīng)在A10的結(jié)構(gòu)上引入了熒光團(tuán)并在熒光團(tuán)的末端接上了供定位基團(tuán)反應(yīng)的烷基氯,。接著，通過鹵素與三苯基膦的反應(yīng)作者得到了含有兩個(gè)三苯基膦的探針中間體A15,；最后,，經(jīng)過水解和加成作者得到了含有AM基團(tuán)的探針mt-fura-2-AM。

圖2. mt-fura-2-AM的定位及其對(duì)鈣離子的熒光成像

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

由于該探針中含有能結(jié)合鈣離子的結(jié)構(gòu),，因此作者首先通過紫外和熒光研究了其光譜性質(zhì)的變化,，結(jié)果表明該探針在結(jié)合鈣離子前后，其最大吸收波長和發(fā)射波長分別從385 nm和540 nm藍(lán)移到了345nm和520 nm,，而其最大激發(fā)波長從350 nm紅移到了400 nm,。此外，與線粒體熒光蛋白的共定位實(shí)驗(yàn)表明所合成的探針確實(shí)能夠如預(yù)期的一樣在進(jìn)入到細(xì)胞后富集到線粒體中,?；谶@些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者研究了該探針在細(xì)胞內(nèi)對(duì)鈣離子濃度變化的響應(yīng),。結(jié)果表明,，350 nm激發(fā)下其熒光信號(hào)在結(jié)合了鈣離子后出現(xiàn)了輕微的增強(qiáng)，而400 nm激發(fā)光下其熒光信號(hào)則出現(xiàn)了明顯的降低,，而兩者的比例在結(jié)合前后的變化則高達(dá)300%,。值得注意的是，與之前報(bào)道了基于羅丹明的線粒體鈣離子探針相比,，新制備的mt-fura-2-AM具有更高的光穩(wěn)定性,，并且不會(huì)輕易地從線粒體中泄露出來,。

最后，作者利用探針對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)鈣離子流進(jìn)行了實(shí)時(shí)的分析,，并且成功觀測(cè)到了KCl刺激下心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增長,。

全文作者：Diana Pendin, Rosa Norante, Andrea De Nadai, Gaia Gherardi, Nicola Vajente, Emy Basso, Nina Kaludercic, Cristina Mammucari, Cristina Paradisi, Tullio Pozzan and Andrea Mattarei。