熒光定量PCR試劑系列之一：關(guān)于報告基團及淬滅基團的選擇

謙謙君子一笑 2019-03-25

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在探針法qPCR實驗，尤其是多重?zé)晒舛繉嶒炛?，關(guān)于熒光報告基團及熒光淬滅基團的選擇,，是影響實驗效果的極其重要的一環(huán)。本文將從一則故障排查說起,，介紹報告基團及淬滅基團選擇上面的一些建議,，希望能對大家的多重?zé)晒舛縋CR實驗有所幫助。

1. 問題現(xiàn)象

客戶反映用ROX標(biāo)記的內(nèi)參GAPDH探針無擴增,，而同一個體系中FAM標(biāo)記的目的基因探針正常擴增（圖1）,。

2. 原因排查

查看客戶數(shù)據(jù)的多組分圖（圖2），發(fā)現(xiàn)ROX初始熒光值很高,，但始終沒有抬升,，而FAM則正常抬升。與客戶確認使用的Master Mix中不含ROX后,，考慮到同一體系中FAM熒光結(jié)果正常,，因此初步排除Master Mix和樣本的問題，懷疑是ROX探針的問題,。

客戶表示該探針的序列是來自于相關(guān)文獻,，他只是根據(jù)自己的實驗需要修改了熒光標(biāo)記形式。在與客戶核對該探針的熒光標(biāo)記時發(fā)現(xiàn),，客戶使用的報告基團為ROX,，而淬滅基團竟然選擇了TAMRA！因此該探針信號沒有抬升的問題確實是出在熒光標(biāo)記上,。

回想一下水解探針法中涉及到的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）,。由于ROX的波長長于TAMRA（圖3），故其能量低于TAMRA,，所以能量不可能由ROX轉(zhuǎn)移至TAMRA,，也就是說，TAMRA不能淬滅ROX等波長比它長的熒光,。這就導(dǎo)致了在該實驗中,，ROX的信號在實驗初始階段就比較高，而且也不會隨著循環(huán)的進行,、擴增產(chǎn)物的增多而升高,，使得結(jié)果看起來好像是ROX探針沒有擴增。

3. 解決方案

建議客戶重新合成這條探針,。

客戶使用的儀器為StepOnePlus,，由于這一體系中已有一條標(biāo)記目的基因的FAM-MGB探針,，客戶之后還打算再加入一條VIC-MGB的探針來標(biāo)記另一目的基因，因此這條內(nèi)參探針可以使用第三通道的NED作為報告熒光,。

此外,，考慮到同一反應(yīng)體系中不建議放置超過兩條MGB探針，且原有的內(nèi)參探針序列也不是按MGB探針設(shè)計的,，因此該探針的淬滅基團可以使用無熒光的淬滅基團形式,。同時建議客戶留出第四通道，將ROX作為參比熒光,。

4. 小結(jié)

我們經(jīng)常接到客戶的問題反饋,，說沒有擴增，特別是當(dāng)客戶使用自己合成的引物,、探針（而非購買商業(yè)化的Assay）時,，我們通常考慮的是引物,、探針設(shè)計或者實驗條件不合適導(dǎo)致擴增失敗等原因。而在這個案例中,，則是由于熒光基團選擇不合適而導(dǎo)致無法檢測到擴增,。看似簡單的道理,，但是對于一些剛剛接觸探針法定量實驗的客戶來講,，卻是有可能會忽略的問題。那為了避免類似的問題再次發(fā)生,，我們在選擇報告基團和淬滅基團時,，需要注意些什么呢？

5. 補充——關(guān)于報告基團和淬滅基團的選擇

使用報告基團和淬滅基團標(biāo)記的雙標(biāo)探針在基因分析中應(yīng)用十分廣泛,。寡核苷酸探針的兩端分別被標(biāo)記上報告基團和淬滅基團,，通過熒光共振轉(zhuǎn)移的原理，報告熒光只在這兩種基團通過雜交或者核酸酶水解分開時才被釋放,。以下是對于報告基團及淬滅基團選擇的一些建議：

1）選擇報告基團時首先要確認激發(fā)波長和發(fā)射波長與儀器是匹配的,。例如在我們的StepOne儀器上就不能夠使用第三通道的熒光染料如NED, TAMRA等。對于多重?zé)晒夥磻?yīng),，標(biāo)記不同探針的報告基團染料的最大發(fā)射波長應(yīng)該至少有15nm的差異,。針對不同的機型，我們建議的多重?zé)晒饨M合如下：

2）對于淬滅基團,，必須要保證其吸收光譜與報告基團的發(fā)射光譜有重合,。例如第一代雙標(biāo)探針使用TAMRA作為淬滅基團（吸收波長558nm），可以淬滅FAM（發(fā)射波長517nm）和VIC（發(fā)射波長552nm）,。但是由于TAMRA有自己的發(fā)射熒光（577nm）,，從而會增加背景熒光信號，同時還要占用一個熒光通道，減少了儀器的檢測通道,，因此,，TAMRA探針現(xiàn)在使用的已經(jīng)比較少了。而目前使用最為廣泛的是諸如MGB-NFQ,，QSY等無熒光的淬滅基團,，它們吸收報告基團所發(fā)出的熒光之后，會以熱量形式將能量散發(fā)出去,，而不是以熒光的形式散發(fā),，所以背景信號很低，可以達到更高的檢測靈敏度,。

比如大名鼎鼎的MGB探針,，其淬滅基團實際上是由兩部分組成，一部分是3肽結(jié)構(gòu)的MGB（Minor Groove Binder,，小溝結(jié)合物）,，可以起到穩(wěn)定DNA雙鏈結(jié)構(gòu)、提高退火溫度的作用,；而真正發(fā)揮熒光淬滅作用的是另外一部分結(jié)構(gòu),，即NFQ（non- fluorescence quencher）。MGB-NFQ的完整結(jié)構(gòu)見下圖4：

而QSY探針,，則是采用了Applied Biosystems新近推出的淬滅基團形式,。它是一種全新的無熒光淬滅基團，可以與FAM,、VIC,、ABY及JUN等報告基團完美搭配，兩者結(jié)合,，在多重檢測應(yīng)用中可以充分提高PCR性能,，在Applied Biosystems原有的MGB探針之外，又為qPCR多重檢測設(shè)計增添了一把利器,。如下圖5,，在多重檢測中，在采用相同的探針序列和預(yù)混液的情況下,，ABY-QSY探針的熒光強度要明顯強于CF590-BHQ探針,。