使用函數(shù)讀readTargets(file="Targets.txt", path=NULL, sep="\t", row.names=NULL, quote="\"",...),。這個函數(shù)其實是一個包裝了的read.table()，讀入的是樣本的信息,，創(chuàng)建的對象類似于marray包的marrayInfos和Biobase包的AnnotatedDataFrame,。

與marray包一致，Bioconductor不能讀入原始的TIFF圖像文件,，只能輸出掃描儀輸入的,、轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號的文本文件。使用函數(shù)read.maimages(files=NULL, source="generic", path=NULL, ext=NULL, names=NULL, columns=NULL, other.columns=NULL, annotation=NULL, green.only=FALSE, wt.fun=NULL, verbose=TRUE, sep="\t", quote=NULL, ...)

參數(shù)說明：files需要通過函數(shù)dir(pattern = "Mypattern")配合正則表達式篩選（規(guī)范命名很重要），同時該函數(shù)可以讀入符合格式的壓縮過的文件,，比如*.txt.gz的文件,，這極大的減小的數(shù)據(jù)儲存大小；source的取值分為兩類,，一類是“高富帥”,，比如“agilent”、“spot”等等（下表）,，它們是特定掃描儀器的特定輸出格式,；如果不幸是“屌絲”，即格式是自己規(guī)定的,，可以選定source="generic",，這時需要規(guī)定columns；任何cDNA文件都要有R/G/Rb/Gb四列（Mean或者Median）,；annotation可以規(guī)定哪些是注釋列,；wt.fun用于對點樣點進行質(zhì)量評估，取值為0表示這些點將在后續(xù)的分析中被剔除,，取值位1表示需要保留,，對點樣點的評估依賴于圖像掃描軟件的程序設(shè)定，比如SPOT和GenePix軟件,，查看QualityWeights（現(xiàn)成函數(shù)或者自己寫函數(shù)）,。

讀入單通道數(shù)據(jù)：讀入單通道數(shù)據(jù)，可以設(shè)定green.only = TRUE即可,，然后對應(yīng)讀入columns = list(G = "Col1", Gb = "Col2"),。

讀入的數(shù)據(jù)，如果是單通道,，則成為EListRaw class,；如果是雙通道，則是RGList class,。

數(shù)據(jù)操作：

cbind()：合并數(shù)據(jù),；

“[”：分割數(shù)據(jù)；

RGList class有的names是 "R",，"G",，"Rb"，"Gb",，"weights",，"printer"，"genes",，"targets",，"notes"：  R/G/Rb/Gb分別紅和綠的前景和背景噪音,；weight是掃描軟件的質(zhì)量評估；printer是點樣規(guī)則（printer layout）,；genes是基因注釋,；target是樣本注釋；notes是一般注釋,?？梢酝ㄟ^myRGList$names進行相應(yīng)的取值和賦值。

cDNA芯片前處理的流程是：背景去除（background correction）--> 組內(nèi)歸一化（with-array normalization）--> 組間歸一化（between-array normalization）,。最后一步組間歸一化可選,，注意trade-off原則。

3.1 背景去除： 

RG：可以是EListRaw,，也可以是RGList class,；

method：取“auto”,，“none”，“subtract”,，"half",，"minimum"，"movingmin",，"edwards"或者"normexp",；

normexp.method：在method取“normexp”時，可以取"saddle",，"mle",，"rma"或者"rma75"。

作者建議使用“mle”或者“saddle”,，兩個運行速度也差不多,。如果數(shù)據(jù)中含有“形態(tài)背景估計（morphological background estimates）”，比如SPOT和GenePix圖像處理軟件,，那么method = "subtract"也就較好的表現(xiàn),。

method："none"，"median",，"loess"，"printtiploess",，"composite",，"control"和"robustspline"。初始值設(shè)定為“printtiploess”,，但是對于Agilent芯片或者小樣本芯片（每個“點樣塊”少于150個探針）,。可用選用的loess或者robustspline,。“l(fā)oess歸一化方法假設(shè)了有相當大的一部分探針沒有發(fā)生差異化表達,，而不是上調(diào)或者下調(diào)的基因數(shù)差不多或者差異化程度圍繞著0波動,。”（參考文獻1）,。需要注意，組內(nèi)歸一化只是對單張芯片的M值進行了規(guī)整（不影響A值）,，但是對與組間各個通道沒有進行比較,。

weight：是圖像處理軟件對探針權(quán)重的標記,，如果使用weight,，那么在歸一化過程中weight為0的探針不會影響其他探針，這并不意味著這些探針會被剔除,，它們同樣會被歸一化,，也會出現(xiàn)在歸一化的結(jié)果中,。如果不想使用,，那么weight設(shè)為NULL。

iterations：設(shè)定loess的循環(huán)數(shù),，循環(huán)數(shù)越多,，結(jié)果越強健（robust）,。

以下是一個cDNA芯片的密度圖，分別為原始,、去背景（method = "normexp", normexp.method="mle"）,、組內(nèi)歸一化（method = "robustspline"）和組間歸一化（method = “quantile”），使用plotDensities()繪制,。

“線性模型”主要分析差異化表達基因,，使用這種方法需要準備兩個矩陣：“實驗設(shè)計矩陣（design matrix）”和“對比矩陣（contrast matrix）”?！皩嶒炘O(shè)計矩陣”主要用于每張芯片上用的RNA樣品種類,，“對比矩陣”主要用于規(guī)定實驗組和對照組。

“實驗設(shè)計矩陣”：列表示RNA樣品種類,，對于oligo芯片或者使用common reference的cDNA芯片（簡稱第一類）,，列數(shù)與不同RNA樣品數(shù)恰好相同；行數(shù)等于芯片數(shù),。對于不同染料對應(yīng)不同樣品的cDNA芯片（簡稱第二類）,，列數(shù)比RNA樣品數(shù)恰好少一,，行數(shù)等于芯片數(shù)（如要要衡量染料效應(yīng)（dye effect）,，則列數(shù)與第一類相同）。對于第一類芯片,，使用model.matrix()函數(shù)創(chuàng)建“實驗設(shè)計矩陣”：比如oligo芯片model.matrix(~ 0+factor(c(1,1,1,2,2,3,3,3)))表示三類RNA樣品,；對于cDNA芯片，modelMatrix(targets,ref="EGFP")創(chuàng)建以“EGFP”為common reference的矩陣,。對于第二類芯片,，需要手動創(chuàng)建。

“對比矩陣”通過函數(shù)makeContrasts()函數(shù)創(chuàng)建,。

使用步驟：創(chuàng)建“實驗設(shè)計矩陣” --> lmFit() --> 創(chuàng)建“對比矩陣”（此步可選,，如正交實驗） --> contrasts.fit()（接上步，可選）--> eBayes() --> topTable(),。文檔詳細列出了各種各樣的例子,。

 比較有用的例子：

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# 假定這六張芯片每兩兩做技術(shù)重復(fù)

> design <- c(1, -1, -1, 1, 1, -1)

> corfit <- duplicateCorrelation(beta7pq, design, ndups=1, block = c(1, 1, 2, 2, 3, 3), weight = NULL)

> fit <- lmFit(beta7pq, design, block = c(1, 1, 2, 2, 3, 3), cor = corfit$consensus)

> fit <- eBayes(fit)

> topTable(fit, adjust = "dfr")

# 也可以采用以下方法

> design <- modelMatrix(beta7pq$targets, ref = "b7 -")

> design <- cbind(Dye = 1, desigh)

> fit <- lmFit(beta7pq, design)

> colnames(design)[2] <- "b7"

> cont.matrix <- makeContrasts(MUvsWT = b7/2, levels = design)

> fit2 <- contrasts.fit(fit, cont.matrix)

> fit2 <- eBayes(fit2)

> topTable(fit2, adjust = "fdr")

#  兩者有些不同，原因可能是第一種方法是專門為“對稱”的cDNA芯片設(shè)計,，而第二種是為非對稱設(shè)計,。

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4.2 類型2的芯片

參考文獻8.4和8.5節(jié)。其中用到了model.matrix()這個函數(shù),，什么意思,？

參考文獻8.6和8.7節(jié),。

參考文獻8.8節(jié)

5. 做圖

z：可以定義R/Rb/G/Gb，也可以是導(dǎo)數(shù),；

low/high：規(guī)定顏色,，比如low = "white" , high = "red"

下圖是一張芯片的綠色前景圖、紅色背景圖和log-ratio圖（M值圖）：

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> imageplot(beta7q$M[, 1], beta7$printer)

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也可以使用imageplot3by2(RG, z="Gb", prefix=paste("image",z,sep="-"), path=NULL, zlim=NULL, common.lim=TRUE, ...),，將圖以3*2的格式六個一組保存成圖片,。

5.2 M-A圖

使用plotMA(MA, array=1, xlab="A", ylab="M", main=colnames(MA)[array], xlim=NULL, ylim=NULL, status, values, pch, col, cex, legend=TRUE, zero.weights=FALSE, ...)畫單個MA圖。但這個函數(shù)有些問題,，有時畫不出,。所以，完全可以自己來畫,，比如：

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# plot the MAplot befor normalization

> M <- log2((beta7$R[, 1]-beta7$Rb[, 1])/(beta7$G[, 1]-beta7$Gb[, 1]))

> A <- (log2((beta7$R[, 1]-beta7$Rb[, 1]))+log2((beta7$G[, 1]-beta7$Gb[, 1])))/2

> plot(A, M, cex = 0.5)

# we can also plot the MAplot above using marray package

> beta7ma <- as(beta7, "marrayRaw")

> plot(maA(beta7ma)[,1], maM(beta7ma)[, 1])

# plot the MAplot after normalization

> plot(beta7q$A[, 1], beta7q$M[, 1], cex = 0.5)

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使用plotPrintTipLoess(object,layout,array=1,span=0.4,...)畫print-tip的MA圖,，下圖分別是歸一化前和后的print-tip的MA圖。

使用boxplot()畫盒箱圖,，使用plotDensity()畫密度曲線圖,。下圖為原始數(shù)據(jù)、組內(nèi)歸一化（method = "normexp", normexp.method="mle"）和組建歸一化（method = "scale"）的盒箱圖,。

最后,，還可以使用 volcanoplot(fit, coef=1, highlight=0, names=fit$genes$ID, xlab="Log Fold Change", ylab="Log Odds", pch=16, cex=0.35, ...)畫“火山圖”（highlight標記前N個差異基因）；

使用vennDiagram(object, include="both", names, mar=rep(1,4), cex=1.5, lwd=1, circle.col, counts.col, show.include, ...)畫“韋恩圖”,；

使用plotMDS()繪制多緯標度圖（multidimensional scaling plot, MDS）,。

參考文獻：limma: Linear Models for Microarray Data User’s Guide