“染色”包括固定標(biāo)本的抗原修復(fù)（未固定冰凍標(biāo)本不需要修復(fù)操作，這里請(qǐng)參考一下本俠自從寫blog以來首次發(fā)表的“重要說明”,，在文末）,、封閉、抗體孵育,、顯色,。其實(shí)在抗原修復(fù)之前還有兩個(gè)步驟,，是免疫組化特有的，因?yàn)槭切?dòng)作同時(shí)又為了銜接之前Western的思維（如果不同方法從原理和操作上歸納得比較相似,，就比較利于理解和掌握），本俠就沒有寫,，這兩個(gè)步驟分別是：細(xì)胞通透（這個(gè)詞從字面上看,，它所表達(dá)的意思可是一點(diǎn)也不通透啊，等會(huì)兒跟大家解釋）和滅活內(nèi)源性過氧化物酶,。這兩個(gè)步驟存在的原因也是之前我們提到的,，免疫組化的樣本比較原汁原味，細(xì)胞可能是完整的（只要沒有被刀片從中間劈開）,，所以它就比Western所用的經(jīng)過提煉和處理的蛋白樣本復(fù)雜的多,，需要面對(duì)的因素也要多得多。

如果是做石蠟切片,，在做抗原修復(fù)之前,，還得再有一個(gè)額外的步驟，就是脫蠟,。因?yàn)闃颖臼潜宦裨谑灷锩娴?，如果帶著石蠟一起做染色，妥妥的是染不出來的,，所以首先要把石蠟去除,，這個(gè)步驟就叫做“脫蠟”。脫蠟用的試劑是“二甲苯”,，因?yàn)槭災(zāi)苋苡诙妆剑▋烧邩O性都很小,，學(xué)過有機(jī)化學(xué)的小伙伴們一定聽過“相似相溶原理”）。但是固態(tài)的石蠟不易溶于二甲苯,，所以在用二甲苯脫蠟之前,，需要將切片放至60℃烘箱烤上45min（請(qǐng)參見小貼士1），待石蠟出現(xiàn)肉眼可見的融化,，迅速將切片浸到二甲苯中,，為了確保石蠟被溶解干凈，二甲苯溶解石蠟的操作一般做兩遍,。二甲苯處理完成,，我們肯定不能把粘著二甲苯的切片拿去染色，得先把二甲苯洗掉,，但是剛剛提到過,，二甲苯極性很小，我們不可能用PBS或者水把它洗干凈（因?yàn)樗臉O性很大）,，然而對(duì)于做染色來說,，系統(tǒng)里對(duì)染色影響最小的溶液也就是PBS或水了,，怎么才能把切片最后用PBS或者水來清洗呢？我們只能再次利用“相似相溶原理”一點(diǎn)點(diǎn)提升溶液的極性,。我們先用純的酒精來洗掉二甲苯,，再用酒精和水的混合物（也就是高濃度或低濃度酒精）來不斷稀釋純的酒精以及殘留的二甲苯，最后用水來洗掉酒精,，搞定,！而且最后用水來洗片還可以達(dá)到所謂“水化”的效果，本俠沒查到能說服自己的原理,，據(jù)說對(duì)染色很好,，額……好吧。不過每次遇到這類操作,，我都不禁感嘆,，究竟是什么樣的大神，上通天文,、下知地理,，才能想到這樣的方法，五體投地,！

首先把切片放到染色架上（可以放多張片子）,，然后用繩子把染色架拴起來方便拿來拿去，尤其是放進(jìn)染色缸的時(shí)候就太方便了,。接著把染色架（當(dāng)然上面有切片啦）放進(jìn)烘箱讓石蠟融化,，然后拎著染色架放進(jìn)盛有二甲苯的染色缸，靜置15min,，下面的流程是：二甲苯（另一個(gè)缸）15min,；100%酒精2min；90%酒精2min,；80%酒精2min,；70%酒精2min；蒸餾水2min,；蒸餾水（另一個(gè)缸）2min,。這一套過程下來，脫蠟完成,！所以這就意味著,，你要準(zhǔn)備8個(gè)大染色缸（下圖中不帶卡槽的那種），分別裝上上述流程的液體,，液體的量需要至少能淹沒所有切片,。

為了保證在染色過程中試劑充分進(jìn)入細(xì)胞，脫蠟完成后需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透操作,，說白了就是在細(xì)胞上打洞,。打洞的試劑常用的有TritonX-100和蛋白酶k（常用濃度網(wǎng)上都有）,。從這里開始，染色步驟開始出現(xiàn)一些精致操作：由于切片很小,，加上某些試劑很昂貴（比如抗體）,，所以我們希望盡量少用點(diǎn)試劑。于是就出現(xiàn)了直接把試劑點(diǎn)在切片上的做法（而不是像脫蠟?zāi)菢佑蒙蠋装俸辽后w浸泡切片）,，這樣也許只需100微升試劑就足夠了,。但是液體在玻片上不一定能固定邊緣，很可能會(huì)淌走,，所以就需要把試劑“圈”在組織周圍，于是一個(gè)用于畫“圈”的神筆就誕生了（請(qǐng)見下圖）,。

不用本俠提示,，小伙伴們也能猜到，這樣一支筆肯定很貴,。奈何天無絕人之路,，不想花重金買這支筆的，用指甲油也可以喲,，不要怪我沒提醒你指甲油也有高低檔次,，但效果沒差。細(xì)胞通透完,，再把切片放入用PBS配制的3%H2O2中浸泡15min（這時(shí)用的染色缸可以是沒有卡槽的大缸,，也可以用有卡槽的小缸，如果用有卡槽的,，需要把載玻片一張張插進(jìn)去）,，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶（請(qǐng)參見小貼士2）。這么做的原因是抗體孵育時(shí)用的二抗通常是HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的（當(dāng)然也有其它酶標(biāo)記的,，比如堿性磷酸酶標(biāo)記,，看你買哪種了。但請(qǐng)注意,，標(biāo)記不同,，顯色底物也要相應(yīng)更換），顯色的時(shí)候我們會(huì)用過氧化物酶的底物與HRP反應(yīng),，如果樣本本身也含有過氧化物酶的話,，那么底物也會(huì)與樣本中的過氧化物酶反應(yīng)，造成假陽性,，所以我們需要事先用H2O2把樣本中自帶的過氧化物酶滅活,。

接下來的步驟就是期待已久的甲醛或多聚甲醛固定樣本所需要做的“抗原修復(fù)”（請(qǐng)參見小貼士3）。比較常用的修復(fù)方法是熱修復(fù),，有些地方也叫高溫修復(fù),，還有的地方叫做微波修復(fù),，做法也很簡單，先把修復(fù)液（關(guān)于修復(fù)液,，請(qǐng)參見小貼士4）放進(jìn)微波爐,，高火5min讓修復(fù)液沸騰，然后把切片放到修復(fù)液里,，再放進(jìn)微波爐,，中火10-15min進(jìn)行修復(fù)，最后自然冷卻（約20min）即可,。但是有些抗體是有特殊要求的,，比如需要進(jìn)行酶修復(fù)，那么就必須按照抗體說明書來,。所以進(jìn)行抗原修復(fù)之前,，請(qǐng)先仔細(xì)閱讀抗體說明書，如果說明書沒有說明,，可以嘗試用熱修復(fù),。修復(fù)完就是我們熟悉的封閉過程了，用PBS配制5%的BSA,，點(diǎn)到樣本上,，37℃（室溫也行）孵育1h就可以了。封閉液的濃度可以自己根據(jù)需要調(diào)整,，但是本俠建議大家不要提高到10%,，會(huì)比較粘稠，效果沒覺得有多好,，但是卻很難洗掉,。一抗和二抗的孵育，與Western類似,，不同的是,，稀釋好的抗體也是點(diǎn)在切片上的，體積很少,?？贵w都可以用1%BSA稀釋，也有實(shí)驗(yàn)室直接用PBS稀釋抗體,，都行吧,。一抗孵育先用4℃過夜，然后37℃再孵育1h（請(qǐng)參見小貼士5）,，二抗用37℃,，1h即可。染色過程中所有的洗滌步驟都在有卡槽的染色缸進(jìn)行,，將載玻片插入染色缸,，倒入PBS,，放在搖床上洗滌。

最后還有一步就是顯色,，這一步也很簡單,，買一個(gè)市售的DAB試劑盒（如果二抗是HRP標(biāo)記的話，如果不是HRP,，那就什么酶買什么底物）,，按照說明書操作即可。染完我們想要染的目的蛋白,，一般我們還會(huì)再復(fù)染一下蘇木素,，這樣可以把細(xì)胞識(shí)別出來，目的是防止染出來的目的蛋白不在細(xì)胞上,，是個(gè)假陽性結(jié)果,。蘇木素復(fù)染同樣很簡單，買來后直接滴在染好目的蛋白的切片上,，等1-2min，用水沖洗多余的染液就行了,。所有操作做完以后,，如果標(biāo)本想長期保存，需要進(jìn)行封片,，常用的封片劑是中性樹膠,，本俠封片不專業(yè)，就是等染色標(biāo)本風(fēng)干后,，直接將中性樹膠點(diǎn)在樣本上加蓋玻片,，好像也沒什么問題。但是有些顯色液不適合用中性樹膠封片,，比如需要用水溶性的封片劑,，那么小伙伴們需要根據(jù)底物要求選擇合適的封片劑。