【實(shí)驗(yàn)原理】

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無(wú)菌操作,，避免微生物及其他有害因素的影響,。一般標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)室應(yīng)包括配液室、準(zhǔn)備室和培養(yǎng)室,。三室既相互連接又相對(duì)獨(dú)立,，各自完成培養(yǎng)過(guò)程中的不同操作。

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>

①了解培養(yǎng)室的設(shè)置和設(shè)備,。

②學(xué)習(xí)無(wú)菌概念和無(wú)菌操作要領(lǐng)。

【操作步驟】

1．實(shí)驗(yàn)室設(shè)置

（1）配液室

（2）準(zhǔn)備室

（3）培養(yǎng)室

培養(yǎng)室內(nèi)要完全密閉,，保持恒定的溫度,，在設(shè)計(jì)上要注意以下幾點(diǎn)：

①培養(yǎng)室的位置最好設(shè)在陰面，陽(yáng)光不能直接照射的地方,，防止室內(nèi)溫度增高,。

②天花板的高度不要超過(guò)2米，以保證紫外燈的有效殺菌效應(yīng)，

③門一般用拉門,，以防止空氣流動(dòng),。

④天花板、地板和四周墻壁要光滑無(wú)死角,，要鑲瓷磚或涂油漆,，這樣設(shè)計(jì)，一是便于清洗和消毒,，另外也不易在墻角堆積灰塵,。

2．實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備

（1）準(zhǔn)備室的設(shè)備

①雙蒸餾水蒸餾器：制備雙蒸水。

②酸缸：盛洗液,，浸泡玻璃器具,。

③烤箱：洗滌完的玻璃器皿用烤箱烘干。

④高壓鍋：玻璃器皿,、解剖用具,、部分液體、塑料器具等滅菌,。不同物品其有效滅菌壓力和時(shí)間不同,。

⑤儲(chǔ)品柜1：放置未消毒物品。

⑥儲(chǔ)品柜2：放置已消毒物品,。

⑦包裝臺(tái)：滅菌前的包裝用,。

準(zhǔn)備室注意事項(xiàng)：

①預(yù)防蒸餾器被烤干。

②放置水池中的水滲出,。

③勿將酸液濺到衣物或地面,。

④勿將高壓鍋排氣閥和安全閥堵塞。

⑤已消毒物品應(yīng)與未消毒物品分柜存放,。

（2）配液室的設(shè)備

①天平（扭力天平和電子天平）：稱量用

②pH計(jì)：

③磁力攪拌器：

（3）細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)備

①超凈工作臺(tái)：

超凈工作臺(tái)的種類很多,，有單面單人、單面雙人,、雙面雙人或雙面四人等,，其工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)，使通過(guò)高效濾氣的空氣,，徐徐通過(guò)臺(tái)面,，這樣使工作環(huán)境中具無(wú)菌而均勻的空氣。

根據(jù)層流方式的不同,，超凈工作臺(tái)主要分為水平層流式和垂直層流式兩種,，基本原理大致相同，都是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過(guò)濾器初濾,，由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱,，再經(jīng)高效空氣過(guò)濾器,，由此送出的潔凈氣流從一定的均勻的斷面風(fēng)速通過(guò)無(wú)菌，從而形成無(wú)塵無(wú)菌的高潔凈度工作環(huán)境,。但兩種凈化臺(tái)的氣流方向不同,。

使用超凈工作臺(tái)應(yīng)注意的幾點(diǎn)問(wèn)題：

A．凈化工作臺(tái)最好安裝在無(wú)塵的房間內(nèi)，最好為隔離好的無(wú)菌間內(nèi),，以免塵土過(guò)多易使濾器阻塞,，降低凈化效果，縮短使用壽命,。

B．新安裝的或長(zhǎng)期未使用的工用臺(tái),，工作前必須對(duì)工作臺(tái)和周圍環(huán)境用真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的工具進(jìn)行清潔工作，再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌法進(jìn)行滅菌處理,。

C．每次使用工作臺(tái)時(shí),，應(yīng)先用75%酒精擦洗臺(tái)面，并提前以30~50min紫外線滅菌燈處理凈化工作區(qū)內(nèi)積累的微生物,。在關(guān)閉紫外燈后應(yīng)啟動(dòng)送風(fēng)機(jī)使之運(yùn)轉(zhuǎn)兩分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作,。

D．凈化工作區(qū)內(nèi)不應(yīng)存放不必要的物品，以保持潔凈氣流型不受干擾,。

E．一般情況下,，高效過(guò)濾器三年更換一次。更換高效濾器應(yīng)請(qǐng)專業(yè)人員操作,，以保持密封良好,。要定期將粗過(guò)濾器中的過(guò)布（無(wú)紡布）拆下清洗，時(shí)間應(yīng)根據(jù)環(huán)境潔凈程度而定,，通常間隔3~6個(gè)月進(jìn)行一次,。

F．每次使用凈化臺(tái)要及時(shí)清除工作臺(tái)面上的物品，并用灑精擦洗臺(tái)面使之始終保持潔凈,。

②4℃冰箱和低溫冰箱：

③CO₂培養(yǎng)箱：

A．一定濃度的CO₂對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng),，尤其是原代培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)有促進(jìn)作用（5%）。

B．一定濃度的CO₂可維持培養(yǎng)液恒定的pH,。適用于開放培養(yǎng),，培養(yǎng)箱封口后，可在一般恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),，但是采用培養(yǎng)皿或多孔板培養(yǎng)時(shí),，則需要高濕度和高CO₂含量的空氣。

C．它增加了濕度,，箱體內(nèi)裝有水浴,，可以保證培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度。

D．培養(yǎng)箱內(nèi)裝有紫外燈,。

E．通過(guò)氣體流量計(jì)可以調(diào)節(jié)CO₂和空氣的比例。

F．在水中可加入防腐劑（二氧乙酸）?？煞乐挂?/span>CO₂培養(yǎng)箱中濕度較高,，易長(zhǎng)霉菌。

④臭氧發(fā)生器：

④離心機(jī)：

⑤CO₂鋼瓶：

⑥液氮罐：

⑦儲(chǔ)品柜：用來(lái)存放雜物

⑧紫外燈：

⑨空氣凈化系統(tǒng)

⑩倒置顯微鏡

3．無(wú)菌操作

（1）無(wú)菌室的滅菌：

①紫外燈無(wú)人時(shí)就要打開,；

②進(jìn)無(wú)菌室要穿無(wú)菌服,、戴帽子和口罩；

③每周清洗消毒一次,；

④所用物品要以外科手術(shù)方式嚴(yán)格消毒,；

⑤室內(nèi)臺(tái)面要要保持潔凈，做完實(shí)驗(yàn)后,，用75％酒精或千分之三新潔爾滅棉球擦拭超凈工作臺(tái)的臺(tái)內(nèi),、邊臺(tái)的臺(tái)面、倒置顯微鏡的載物臺(tái)等,；

⑥所用物品要一次性準(zhǔn)備好,；

⑦瓶口要用酒精火焰消毒；

⑧盡量減少出入,。

（2）實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：

①肥皂洗手

②穿好隔離衣

③酒精棉球擦手

細(xì)胞培養(yǎng)室必備的設(shè)備有：
1. 超凈臺(tái),；2. 二氧化碳培養(yǎng)箱；3. 倒置顯微鏡,；4. 二氧化碳?jí)嚎s氣體,；5. 液氮罐；6.低溫冰箱（-20度和-70度）,；7. 過(guò)濾裝置,；8. 離心機(jī)；9. 酶標(biāo)儀等等,。
試劑和小的工器具也很多,，如：培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶,、培養(yǎng)板,、移液槍、酸缸,、滴管,、離心管、血球計(jì)數(shù)板,、DMO,、PBS、胰酶等等,。
細(xì)胞培養(yǎng)室,，最好選擇獨(dú)立房間,，超凈臺(tái)應(yīng)放置在比較潔凈的房間，如果條件允許,，最好按潔凈廠房要求設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)室,，即使房間做不到空氣過(guò)濾，也至少應(yīng)是專用的,，進(jìn)出時(shí)要更換工作衣,。