一般來說生物體內基因表達水平恒定（本底表達）,，響應外界壓力時,，基因表達水平才會發(fā)生顯著變化。
我們常說的基因過表達是相對于本底水平的基因表達水平顯著升高,。這種升高背后往往潛藏著基因功能的秘密,，因此我們時常想要通過人為提高基因表達水平，觀察宿主細胞功能變化,，來確定特定基因功能,。最早基因過表達功能的探索來源于 1959 年一項對非整倍體基因組的研究，該項研究證實非整倍體基因和人類遺傳病癥狀有關,。其他基因過表達原因包括轉錄水平提高、基因甲基化程度改變或是染色體結構變化等,，共同點都是下游蛋白質水平升高（非編碼基因體現在RNA水平升高）,，檢測方法一般是qPCR（RNA）和 western blot（蛋白質）。和自然界存在的突變類似,，人為提高基因表達水平的思路有兩個,，分別是提高宿主基因拷貝數和增強基因本底表達水平。
前者我們可以通過質?；虿《镜容d體外源轉入目的基因或基因表達調控元件,，直接或間接增加宿主的基因拷貝數，提高基因表達水平,。
后者則是通過一些化學或大分子誘導劑,，模擬環(huán)境壓力，提高基因的表達水平,。但這種方式對于基因表達的調控是整體性的,，難以限定在個體基因水平,。由于我們在實踐中經常需要研究與特定基因過表達相關的功能，這里主要介紹前一種基因過表達方式,。
直接增加基因拷貝數的方法一般通過載體外源轉入目的基因序列和必須的基因表達調控元件（啟動子等）就能實現,。
間接方法則是外源轉入轉錄因子等基因調控相關蛋白，增強宿主基因本底表達水平,。一個常見例子是轉入 dCas 和 VP64 融合蛋白,，在 gRNA 的介導下，定向增強特定基因的轉錄水平（相關技術的細節(jié)和迭代將在下期推文中為大家介紹）,。相關技術也很成熟,，很多技術服務公司都可以做。基因過表達顧名思義指基因相對本底水平的顯著提高,。大量研究借助基因過表達相關技術揭示了基因功能和下游調控機制,。
從最早在野生型背景下表達野生型基因開始，我們已經開拓了豐富過基因表達技術應用領域,。
既可以在野生型背景下過表達野生型基因,，直接研究基因的功能；也可以在突變型背景下過表達野生型基因,，通過表型變化間接研究基因功能,。當然,，由于基因堿基含量一般較大,，給下游分子克隆和遞送載體提出很高要求。目前大規(guī)?；蚬δ芎Y選已經被更為簡便的基因沉默技術替代,。然而，基因表達在基因功能研究中依然不可替代,，最直接體現在基因功能下游機制研究,。基因表達的下游功能影響核心在于改變原有的生物化學平衡，根據作用結果可以分為抑制和激活兩類,。最直接的抑制方式是通過影響其他蛋白轉錄,、翻譯或降解，直接影響下游蛋白水平,。比如 SMURF2 ubiquitin E3 的過表達可以通過泛素降解途徑顯著減少 KLF5 DNA-binding protein 水平,。此外，如果過表達基因產物本身屬于蛋白復合體或能夠結合形成蛋白復合體,，過表達產物還能通過競爭結合活性結合位點,，影響下游通路中間產物含量，進而抑制影響整個通路的功能,。研究發(fā)現,，單獨過表達 histone H2A/H2B 或 H3/H4 都會導致染色體分離異常,。而同時過表達全部四種組蛋白則能回復正常。最后,，除了競爭結合機制,，如果過表達基因產物屬于激酶類蛋白，其還能通過翻譯后修飾等,，抑制其他蛋白間相互作用,。例如，stress-activated kinase ,，Srk1 過表達能夠導致 Cdc25 蛋白磷酸化失活,，從而導致細胞 G2 期劫持。激活作用也是一樣,。如果過表達基因產物原本在通路中沉默或低水平表達,，過表達后，相應通路就能被激活,。研究發(fā)現,，在成纖維細胞中過表達 MyoD 會激活分化相關通路，使細胞分化為肌肉細胞,。此外,，如果過表達基因產物能和抑制因子或作為激酶修飾相互作用的蛋白，就能直接激活相應通路功能,。相關例子有 Ras-MAPK 通路中的蛋白過表達能夠激活雌激素（estrogen） 受體轉錄活性,。基因過表達時我們不僅需要注意基因本身，還需要考慮基因翻譯蛋白的性質,。基因功能是過表達時需要首先考慮的問題,，一些毒性基因或自殺基因過表達能夠顯著影響宿主活性，影響表達效率,。此外抗病毒基因只能采用質粒方式遞送,。基因負載也是考慮的問題。尤其在外源基因過表達時,，不同遞送載體的外源基因負載量具有固定限制,，超出負載量時容易導致過表達失敗。此外,，外源基因 GC 含量,、重復片段和多聚堿基都對基因合成和后期測序具有不同程度的影響。目前技術條件下的基因過表達水平仍有一定限度,。一般宿主本底本底表達水平高的基因即使外源導入也很難達到引發(fā)功能變化閾值要求,，事先了解表達宿主目的基因的本底表達水平依然很有必要。過表達效率的評估一般包括轉錄水平和蛋白水平，只是用 qPCR 檢測到外源基因轉錄的 RNA 并不能證明過表達的基因與功能變化直接相關,。很多時候我們還需用 WB 檢測目的基因確實翻譯成了蛋白質并引起蛋白水平的顯著變化,。因此了解基因編碼蛋白的性質也很關鍵。不同宿主系統表達的蛋白結構存在差異,。相比于原核表達系統,，真核表達系統蛋白具有更復雜的翻譯后修飾，活性更高,，但相應成本更高,，產量相對較小。對于不同細胞定位的蛋白（如跨膜蛋白和核蛋白等）,，我們還需調整 WB 實驗前蛋白提取方法,，增加對于蛋白的富集。Uniport 網站查詢蛋白時可以獲知蛋白翻譯后修飾的信息,。（上圖示例為 Hepatocyte growth factor, ID：Q08048,。該蛋白 N 端 1-32 號氨基酸為信號肽，具有 α 和 β 兩條鏈）
最后,，過表達蛋白的翻譯后修飾如前導肽,、信號肽、轉運肽和起始氨基酸切除等也會影響最終蛋白結構,，影響連接在肽鏈兩端的其他氨基酸序列,，如熒光蛋白和純化標簽等。如果需要獲取過表達蛋白產物,，還需事先在表達載體上為目的基因增加后期純化標簽（如His標簽）,，以便進一步分離純化。基因過表達技術目前已經發(fā)展較為成熟并被廣泛應用于基因功能研究和蛋白生產當中,，也將極大促進我們對于基因功能的了解,。[1]Prelich G. Gene overexpression: uses, mechanisms, and interpretation[J]. Genetics, 2012, 190(3): 841-854.[2]Fallah A, Estiri H, Parrish E, et al. Biosimilar Gene Therapy: Investigational Assessment of Secukinumab Gene Therapy[J]. Cell Journal (Yakhteh), 2020, 21(4): 433.
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