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在原核蛋白表達(dá)過程中，選擇構(gòu)建一個合適原核表達(dá)體系需要綜合考慮3大因素：表達(dá)載體,、宿主菌株,、表達(dá)誘導(dǎo)條件,以獲得最滿意的表達(dá)效果。
事實上,，在平時的實驗中,，最容易被忽視的就是宿主菌的選擇——多數(shù)人會直接選擇自己實驗室曾經(jīng)用過的表達(dá)菌株，或者是載體配套的菌株,，而不去追究原因——即使表達(dá)結(jié)果不佳,，大多在表達(dá)條件和載體上找原因，也不會考究菌株的選擇是否適合,。
作為原核表達(dá)的宿主,，對外源基因的表達(dá)會產(chǎn)生一定的影響，是勿庸置疑的,。每一個宿主細(xì)胞都像一個微觀的小工廠,，按照細(xì)胞固有的程序完成“你給它們安排的生產(chǎn)任務(wù)”——因為很難親眼觀察微觀世界中表達(dá)是如何進行的，當(dāng)出現(xiàn)問題時,，我們需要經(jīng)驗判斷問題所在,。宿主細(xì)胞對原核表達(dá)可能會產(chǎn)生哪些影響呢？
知其然還要知其所以然,。比如,，菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定,，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株,。堪稱經(jīng)典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型,，也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株,。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計,。
真核細(xì)胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同,，因此，在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時候,，真核基因中的一些密碼子對于原核細(xì)胞來說可能是稀有密碼子,，從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。改造基因是比較麻煩的做法，Rosetta 2系
列就是更好的選擇——這種攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌,，補充大腸桿菌缺乏的七種（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA
及CGG）稀有密碼子對應(yīng)的 tRNA,，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平,。（已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒）
當(dāng)要表達(dá)的蛋白質(zhì)需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時,，可以選擇K–12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione reductase (gor)兩條主要還原途徑雙突變菌株,，顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率,，促進蛋白可溶性及活性表達(dá)。（卡那霉素敏感）
Rosetta-gami? 2則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點,，既補充7種稀有密碼子,，又能夠促進二硫鍵的形成，幫助表達(dá)需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真核蛋白,。（卡那霉素敏感）
Origami B是衍生自 lacZY突變的 BL21菌株,，這個突變能根據(jù)IPTG的濃度精確調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物，使得表達(dá)產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依賴性,。（四環(huán)素敏感）
在決定試用這些名字古怪的菌株時,，有幾個小Tips要注意的，一個是不同菌株有時已經(jīng)攜帶某個質(zhì)?；蛘咭呀?jīng)具有某種抗生素抗性,，要注意自己的表達(dá)質(zhì)粒是否能與之兼容。比如Rosetta 2 已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒,，不能再用氯霉素篩選等等,。 現(xiàn)象 | 可能原因 | 改進方案 | 建議菌株 | 無蛋白表達(dá) | E. coli 的密碼子偏移性 | 補充稀有密碼子的tRNA；將稀有密碼子突變?yōu)槠胀ù竽c桿菌密碼子 | Rosetta 2
Rosetta-gami 2
Rosetta-gami B
RosettaBlue | 出現(xiàn)截短蛋白 | 包涵體 | 二硫鍵形成困難 | 降低宿主胞質(zhì)的還原性,；利用促進二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽 | Origami 2
Rosetta-gami 2
Rosetta-gami B | 表達(dá)過快,，表達(dá)量過高 | 控制優(yōu)化表達(dá)水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化 | Tuner
Rosetta-gami B | 蛋白無活性 | 蛋白錯誤折疊 | 降低宿主胞質(zhì)的還原性,；利用促進二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽 | Origami 2
Rosetta-gami 2
Rosetta-gami B | 控制優(yōu)化表達(dá)水平：降溫,，IPTG濃度優(yōu)化 | Tuner
Rosetta-gami B | 細(xì)胞死亡，生長極困難 | 毒性蛋白 | 更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制 | pLysS 菌株 | 無克隆生長 | 過高本底表達(dá) | 更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制 | pLysS,、pLysE 菌株 |
重組質(zhì)粒和菌株的保存建議
在實驗室里保存重組菌株的時候,，為了挑菌和傳代方便，我們常用LB平板保存在4℃冰箱中,，需要提質(zhì)粒和表達(dá)接種的時候,，就直接從平板上挑菌，但是這
種方法對于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利,，容易出現(xiàn)質(zhì)粒丟失,、表達(dá)水平不穩(wěn)定、菌株退化乃至發(fā)生污染等情況。 我們建議：
1,、 長期存放菌株和pET重組子應(yīng)該存在甘油－70℃保種,。但是要注意高濃度甘油(> 10%)會導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。請盡量保持甘油濃度8％,。（15%濃度的甘油保種液和新鮮菌液1:1就行）
2,、重組質(zhì)粒不宜長期保存于表達(dá)菌株（帶DE3的大腸桿菌）中，請盡量使用帶有recA endA突變的克隆菌株（比如C600,，DH5a）進行質(zhì)粒抽提和保存質(zhì)粒。表達(dá)型的菌株提質(zhì)粒經(jīng)常會有質(zhì)量不高或者背景的問題,。特別是大量抽提,。
其實不僅僅是表達(dá)，建庫克隆都會涉及菌株的不同要求,。感受態(tài)不是目的,，菌株的背景才是關(guān)鍵。
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