前文回顧

單細(xì)胞RNA-seq分析介紹
單細(xì)胞RNA-seq的設(shè)計(jì)和方法

前言

根據(jù)所用文庫制備方法的不同，獲得的RNA序列(也稱reads或tags)有3'(或5')端起始的轉(zhuǎn)錄本(10X Genomics, CEL-seq2, Drop-seq, inDrops)和全長轉(zhuǎn)錄本(Smart-seq)之分。

感興趣的問題關(guān)乎方法的選擇，下面列出了這些方法的優(yōu)點(diǎn)

• 3'（或5'）端測序：

• 通過使用獨(dú)特的分子標(biāo)識符進(jìn)行更準(zhǔn)確的定量,，從而將生物學(xué)拷貝與擴(kuò)增復(fù)制（PCR）進(jìn)行區(qū)分

• 測序的細(xì)胞數(shù)量更多,，可以更好地鑒定細(xì)胞類型群體

• 每個(gè)細(xì)胞成本便宜

• 超過10,000個(gè)細(xì)胞可獲得最佳結(jié)果

• 全長測序

• 異構(gòu)體水平表達(dá)差異的檢測

• 等位基因表達(dá)差異的鑒定

• 少量細(xì)胞的深層測序

• 適合細(xì)胞數(shù)較少的樣本

對于3'端測序和全長測序有許多相同的分析步驟，但是3'方案越來越流行,，并且在分析中還包含一些其他步驟,。因此，我們的材料將著重于基于液滴的方法（inDrops,，Drop-seq,，10X Genomics），詳細(xì)介紹這3'方案的數(shù)據(jù)分析,。

3'末端讀?。òㄋ谢谝旱蔚姆椒ǎ?/span>

了解每個(gè)reads中都包含哪些信息，以及我們?nèi)绾卧谡麄€(gè)分析過程中使用它,，對于scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析是很有幫助的,。

對于3'端測序方法，來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同分子的reads將僅來自轉(zhuǎn)錄本的3’端,，因此具有相同序列的可能性很高,。然而，文庫準(zhǔn)備過程中的PCR步驟也可能產(chǎn)生讀取副本,。為了確定讀數(shù)是生物學(xué)上的還是技術(shù)上的復(fù)制,，這些方法使用唯一的分子標(biāo)識符，即UMIs

• 不同UMI映射到同一轉(zhuǎn)錄本的read來自不同的分子,，是生物學(xué)上的重復(fù)-每個(gè)read都應(yīng)該計(jì)算在內(nèi)

• 具有相同UMI的read源自相同的分子,，在技術(shù)上是重復(fù)的-UMIs應(yīng)折疊以計(jì)入單個(gè)read

• 在下圖中，ACTB的read應(yīng)折疊并計(jì)入單個(gè)read,，而ARL1的read應(yīng)分別計(jì)數(shù)
  

  

因此，我們知道需要跟蹤UMIs,，但是還需要什么其他信息來正確量化我們樣本中每個(gè)細(xì)胞中每個(gè)基因的表達(dá)呢,？無論采用哪種液滴方法，在細(xì)胞水平上進(jìn)行適當(dāng)?shù)亩慷夹枰韵聴l件：

• Sample index(樣本索引)：確定read來自哪個(gè)樣本(在庫準(zhǔn)備過程中添加—需要記錄)

• Cellular barcode：確定read來自哪個(gè)細(xì)胞(每種庫制備方法都有在庫制備過程中使用的細(xì)胞條形碼的庫)

• UMI(唯一分子標(biāo)識符)：確定read來自哪個(gè)轉(zhuǎn)錄分子

• Sequencing read1：Read1序列

• Sequencing read2：Read2序列

例如,，使用inDrops v3的文庫制備方法時(shí),，下面表示如何在四次讀取中獲取所有信息：

• R1 (61 bp Read 1):序列讀取（上邊的紅色箭頭）

• R2 (8 bp Index Read 1 (i7)): 細(xì)胞條形碼 — 讀取細(xì)胞的來源（上邊的紫色箭頭）

• R3 (8 bp Index Read 2 (i5)): 樣本/庫索引 — 讀取樣本的來源(下邊紅色箭頭)

• R4 (14 bp Read 2): read 2和剩余的細(xì)胞條形碼和UMI — 讀取轉(zhuǎn)錄本來源(下邊紫色箭頭)

對于不同的基于液滴的scRNA-seq方法，scRNA-seq的分析工作流程類似,，但它們之間對UMIs,、細(xì)胞ID和樣本索引的解析將有所不同。例如,，下面是10x 序列讀取的示意圖,，其中索引、UMIs和條形碼的放置方式不同：

單細(xì)胞RNA-seq工作流程

scRNA-seq方法將確定如何從測序reads中解析barcodes和UMIs,。因此,，盡管有幾個(gè)具體步驟會略有不同，但無論采用何種方法,，整個(gè)工作流程通常都遵循相同的步驟,。常規(guī)工作流程如下所示：

• 計(jì)數(shù)矩陣的生成（特定于方法的步驟，依方法的不同而有變化）：格式化讀取,，分離樣本,，映射和量化

• 原始計(jì)數(shù)的質(zhì)量控制：過濾質(zhì)量差的細(xì)胞

• 過濾計(jì)數(shù)后的聚類：基于轉(zhuǎn)錄活性的相似性將細(xì)胞聚類（細(xì)胞類型=不同聚類）

• 標(biāo)記鑒定：識別每個(gè)聚類的基因標(biāo)記

• 可選的下游步驟

無論進(jìn)行何種分析，基于每種條件的單個(gè)樣本得出的關(guān)于總體的結(jié)論都不太可靠,。仍然需要生物重復(fù),！也就是說，如果您要得出與總體相對應(yīng)的結(jié)論,，就不能僅僅是單個(gè)樣本,。

計(jì)數(shù)矩陣的生成

我們將首先討論此工作流的第一部分，即從原始測序數(shù)據(jù)生成計(jì)數(shù)矩陣,。我們將重點(diǎn)介紹基于液滴的方法所使用的3'端測序,，如inDrops、10X Genomics和Drop-Seq,。

測序后，測序工具將以BCL或FASTQ格式輸出原始測序數(shù)據(jù),，或生成計(jì)數(shù)矩陣,。如果讀取的是BCL格式，則我們將需要轉(zhuǎn)換為FASTQ格式,。有一個(gè)有用的命令行工具bcl2fastq,，可以輕松地執(zhí)行此轉(zhuǎn)換。

注意：在工作流的此步驟,，我們不進(jìn)行樣本分離,。您可能已對6個(gè)樣本進(jìn)行了測序，但所有樣本的讀數(shù)可能全部存在于同一BCL或FASTQ文件中,。

對于許多scRNA-seq方法,，從原始測序數(shù)據(jù)到生成計(jì)數(shù)矩陣都將經(jīng)歷相似的步驟。

1. 格式化reads并過濾嘈雜的細(xì)胞條形碼

2. 分離樣本

3. Mapping/pseudo-mapping到轉(zhuǎn)錄組

4. 去重UMIs并量化reads

如果使用10X Genomics庫制備方法，則上述所有步驟都將使用Cell Ranger管道(https://support./single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger),。

1. 格式化reads并過濾嘈雜的細(xì)胞條形碼

FASTQ文件可用于解析cell barcodes, UMIs, and sample barcodes,。對于基于液滴的方法，由于以下原因,，許多cellular barcodes將匹配較低的reads次數(shù)(<1000 reads)：

• 死亡細(xì)胞中游離RNA的包埋

• 表達(dá)很少基因的簡單細(xì)胞(紅細(xì)胞等)

• 由于某種原因而失敗的細(xì)胞

在讀取比對之前,，需要從序列數(shù)據(jù)中過濾出這些多余的條形碼。為了進(jìn)行此過濾,，提取并保存每個(gè)細(xì)胞的“細(xì)胞條形碼”和“分子條形碼”,。例如，如果使用'UMIS’工具,，信息將添加到每次讀取的標(biāo)題行,，格式如下：

文庫制備方法中使用的已知細(xì)胞條形碼應(yīng)該是已知的，未知的條形碼將被丟棄,，同時(shí)允許與已知細(xì)胞條形碼有可接受數(shù)量的不匹配,。

2. 分離樣本reads

如果對多個(gè)樣本進(jìn)行測序，則該過程的下一步是對樣本進(jìn)行分離,。這是這個(gè)過程中的一個(gè)步驟,，不是由“UMIS”工具處理的，而是由“zUMI”完成的,。我們需要解析reads以確定與每個(gè)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的樣本條形碼,。

3.Mapping/pseudo-mapping to cDNAs

為了確定read來自哪個(gè)基因，使用傳統(tǒng)的(STAR)或輕量級方法(Kallisto/RapMap)對reads進(jìn)行比對,。

4. 去重UMIs并量化reads

重復(fù)的UMI被剔除,，并且使用Kallisto或featureCounts之類的工具僅量化唯一的UMI。結(jié)果輸出是一個(gè)按基因計(jì)數(shù)的細(xì)胞矩陣：