真核生物中,，蛋白質的翻譯后修飾對于蛋白質的功能具有重要調控作用,。在各種蛋白質翻譯后修飾中，研究最多且過程最為復雜的是蛋白質泛素化修飾,。泛素（ubiquitin,，Ub）是一種具有76個氨基酸的多肽，可以在泛素激活酶（Ub-activating enzymes E1）,、泛素結合酶（Ub-conjugating enzymes E2）以及泛素連接酶（Ub ligases E3）的依次催化下與底物蛋白或者泛素分子共價結合【1】,。E1消耗ATP激活泛素分子通過硫酯鍵形成E1~Ub；E2通過半胱氨酸殘基接收活化的泛素,，形成E2~Ub；E3可以連接E2~Ub和底物蛋白,，催化泛素C端甘氨酸殘基與底物蛋白上賴氨酸（lysine,，K）殘基上的ε-氨基形成異肽鍵（isopeptide bond）共價結合【2】。下一個泛素分子繼續(xù)通過C端甘氨酸殘基與上一個泛素的賴氨酸殘基（K6,、K11,、K27、K29,、K33,、K48 或K63）或者N端的蛋氨酸連接【3】。根據所添加泛素分子數目的不同,，泛素化修飾分為單泛素化修飾和多泛素化修飾,；多泛素化修飾又可根據所連接的賴氨酸位置不同分為K6、K11,、K27,、K29、K33,、K48 和 K63等類型,。單泛素化影響蛋白質的定位及相互作用；多泛素化中以K48類型最多,，K63次之,，K11類型的再次，K48和K11類型的多泛素化修飾介導蛋白質通過26S蛋白酶體降解【2】；酵母和動物中的研究表明K63類型的多泛素化修飾通常不會導致蛋白質依賴于蛋白酶體的降解,，而是導致膜蛋白的內吞,，DNA損傷響應，細胞自噬,，信號傳導等過程【4】,。植物中關于K63類型多泛素化修飾的報道較少，對于植物K63類型多泛素化發(fā)生機制以及對于生長發(fā)育的影響還知之不多,。

近日,，法國巴黎-薩克雷大學（Université Paris-Saclay）的Grégory Vert教授團隊利用轉錄組，蛋白互作組及蛋白質組等方法,，解析了擬南芥K63類型多泛素化修飾的調控網絡,，探索了K63類型多泛素化修飾對植物生長發(fā)育的重要調控功能。相關結果以Advanced Cataloging of Lysine-63 Polyubiquitin Networks by Genomic, Interactome, and Sensor-based Proteomic Analyses為題發(fā)表在The Plant Cell 上,。

在動物中K63多泛素化修飾依賴于E2 UBC13【5】,，研究者將擬南芥UBC13的兩個同源基因UBC35和UBC36同時突變后，K63多泛素化修飾消失,，植株發(fā)育受到顯著影響,，大部分ubc35-1 ubc36-2雙突只活到子葉階段，少量生長到生殖生長階段表型嚴重育性降低,。利用轉錄組分析發(fā)現(xiàn)在UBC35/36敲低的植物中與生物及非生物脅迫相關的基因顯著上調而與芥子油苷代謝,，細胞周期，微管運動及RNA加工相關的基因顯著下調,。

圖1：UBC35和UBC36催化蛋白質的K63多泛素修飾并影響擬南芥生長發(fā)育

為了尋找參與K63 多泛素修飾的E3,，研究者以UBC35、UBC36及四個輔因子UEV1A-D為誘餌,，利用酵母雙雜交進行互作蛋白篩選,。共鑒定到24個互作蛋白，其中13個E3,，大部分屬于RING/U-box家族,，暗示這些E3與UBC35/36構成E2-E3組合參與催化底物蛋白的K63多泛素修飾。

研究者進一步構建了含有可識別K63多泛素修飾的sensor （Vx3K0-NLS-mCit）的轉基因材料,。Vx3K0-NLS-mCit可以特異的結合K63多泛素,，并利用GFP融合蛋白進行定位追蹤和免疫沉淀。研究者對轉基因植株進行蛋白提取,，免疫沉淀,，胃蛋白酶消化及質譜分析后鑒定到約400個含有K63多泛素修飾的蛋白。GO分析表明這些蛋白參與到代謝,、微管運輸,、跨膜轉運,、細胞核轉運蛋白、染色體結構及RNA剪切等過程,。為了進一步驗證Vx3K0-NLS-mCit sensor的可靠性,，研究者將部分該方法鑒定到的底物蛋白接上GFP標簽穩(wěn)定轉化到擬南芥或瞬時表達于煙草葉肉細胞。然后利用GFP抗體進行免疫沉淀,，并用K63多泛素特異抗體進行Western Blot檢測,，的確檢測到在這些蛋白上存在K63多泛素修飾。

圖2：蛋白質K63多泛素化影響的生理過程

綜上所述,，該研究利用轉錄組,，蛋白互作組，蛋白質組等技術,，確認擬南芥K63多泛素修飾依賴于E2 UBC35/36,，鑒定到13個潛在的參與K63多泛素修飾的E3及近400個含有K63多泛素修飾的底物蛋白，構建了擬南芥K63多泛素修飾的網絡,。同時,，該研究揭示了K63多泛素修飾通過調控生物及非生物脅迫響應、物質代謝,、微管運輸,、跨膜轉運、細胞核轉運蛋白,、染色體結構,、RNA剪切等過程影響擬南芥的生長發(fā)育。

論文鏈接：

http://www./content/early/2019/11/11/tpc.19.00568