1.水培實(shí)驗(yàn)：設(shè)置4個(gè)硒酸鈉濃度處理：0, 0.25, 4.0,and 16.0 mg/L,。處理30天后收集樣品：每個(gè)處理組3個(gè)生物學(xué)重復(fù),，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)8棵籽苗。

2.Se含量和形態(tài)的測(cè)定：氫化物-原子熒光光譜法（HG-AFS）+液相色譜原子熒光聯(lián)用儀（LC-HG-AFS）,。

3.代謝組+蛋白組+轉(zhuǎn)錄組測(cè)定分析

4.qPCR基因表達(dá)測(cè)定,。

1.硒酸鹽處理對(duì)碎米薺籽苗生長(zhǎng),、Se含量的影響

硒酸鹽顯著影響了碎米薺的生長(zhǎng),，0.25mg/L處理顯著促進(jìn)生長(zhǎng),，4mg/L處理無顯著影響，而16mg/L處理顯著抑制生長(zhǎng),，（圖1）,，表明該濃度下碎米薺受到了硒酸鹽的毒性影響。碎米薺的總Se含量隨著Se處理濃度的增加而增加（圖1c）,，在0.25,、4.0、16.0mg/L濃度處理下碎米薺的Se含量分別為120.3, 2008.7, 和9955.4 mg/kg,。在各處理組中,，硒代胱氨酸（SeCys2）和Se(Ⅵ)是主要的Se種類,，此外,，SeCys2和Se(Ⅵ)在0.25、4.0,、16.0mg/L濃度處理下分別占總Se含量的22.3%和20.6%,、35.6%和18.9%、31.1%和13.4%,，暗示著碎米薺可以吸收硒酸鹽并直接轉(zhuǎn)化為有機(jī)Se,。

圖1 不同硒酸鹽濃度處理下碎米薺的基礎(chǔ)信息

（a）表型；（b）總鮮重和根重,；（c）總Se含量,。誤差棒上的字母表示有顯著差異(ANOVA, p < 0.05).

2. 碎米薺的代謝組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組表征

4組樣品中共檢測(cè)到2408個(gè)代謝物,，其中有803個(gè)差異表達(dá)代謝物（DEMs）（圖2a）,，PCA分析顯示碎米薺在不同濃度硒酸鹽處理下代謝狀態(tài)顯著改變。在所有DEMs中，有46個(gè)是從內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的,，并根據(jù)人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB）分類法分為19類（圖2b）,。DEMs的KEGG通路富集分析顯示這46個(gè)DEMs富集到以下代謝途徑：次級(jí)代謝物的生物合成（Ko01110）、氨基酸生物合成（Ko01230）,、環(huán)境信息處理途徑的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ko02010)以及基因信息處理途徑的氨?；?tRNA的生物合成(Ko00970)。在這19個(gè)分類中,，有機(jī)氧化合物,，羧酸及其衍生物和吲哚及其衍生物占DEMs中大部分，然而,，大部分DEMs在響應(yīng)硒酸鹽處理時(shí)上調(diào)表達(dá),，而屬于吲哚及其衍生物的3個(gè)DEMs：L-色氨酸、吲哚和5-羥基乙酸吲哚卻顯著下調(diào),，表明它們可能對(duì)碎米薺中Se的積累或耐受起一定作用,。

轉(zhuǎn)錄組中，我們共注釋到26745個(gè)非冗余的轉(zhuǎn)錄本,，從6個(gè)樣品比對(duì)組中（0–0.25, 0–4.0,0–16.0, 0.25–4.0, 0.25–16.0, 4.0–16.0）共篩選到948個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）,。然而，在不同濃度硒酸鹽處理下這些DEGs展現(xiàn)出不同的表達(dá)特征（圖2c）,，進(jìn)行WGCNA分析以找到與碎米薺累積和耐受Se的部分,，該分析能夠找到與碎米薺Se含量和基因相關(guān)的共表達(dá)的基因模塊，分析顯示所有DEGs聚為3個(gè)模塊（藍(lán)綠色,、藍(lán)色和棕色）,，其中，藍(lán)綠色模塊表示與0處理組顯著相關(guān)（圖2d）,。這些基因注釋到eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)中主要富集在轉(zhuǎn)錄,、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和分子伴侶上,。前20個(gè)富集的GO條目顯示藍(lán)綠色模塊中的基因在生物過程中顯著富集,，例如細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、傷害響應(yīng),、植物型超敏反應(yīng)的調(diào)節(jié),，對(duì)真菌的防御響應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)展開的蛋白質(zhì)響應(yīng)。此外,，從碎米薺轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)中共鑒定到7138個(gè)蛋白質(zhì),，其中有2670個(gè)被注釋，通過兩兩比對(duì),，共鑒定到233個(gè)差異表達(dá)蛋白（DEPs）,，表明硒酸鹽處理引起碎米薺蛋白水平的改變（圖2e）,。

圖2 不同濃度硒酸鹽處理下碎米薺差異表達(dá)代謝物（DEMs）、基因（DEGs）和蛋白（DEPs）的總體展示

（a）所有DEMs的熱圖,；（b）所有注釋DEMs的熱圖,；（c）所有DEGs的熱圖；（d）所有DEGs的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,；（e）所有DEPs的熱圖,。

3. 碎米薺中假定的Se轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和同化吸收酶類的鑒定和表達(dá)特征

我們?cè)谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到746個(gè)非冗余的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中,，有35個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因響應(yīng)硒酸鹽處理且差異表達(dá),，主要屬于磷酸丙糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,、硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,、ZIP鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，K +轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和ATP結(jié)合（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（圖3a）,，有趣的是,，硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在硒酸鹽處理下上調(diào)。硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被注釋為Sultr1;1,、Sultr1;2和Sultr2;1,，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被注釋為ABCF5和ABCG40，這5個(gè)基因顯著上調(diào),，在16 vs 0組中,，這5個(gè)基因分別上調(diào)了4.5-、5.4-,、12.7-,、7.1-和5.9-倍（圖3b）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示碎米薺的Sultr1;1,、Sultr1;2和Sultr2;1與其他植物的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白聚類在一起,，表明他們?cè)赟e運(yùn)輸方面發(fā)揮著相似功能。此外,，硒酸鹽處理還顯著上調(diào)了3種硫酸鹽同化酶：ATP硫酸化酶2（APS2）,、腺苷5'-磷酸磷酸還原酶1（APR1）和腺苷5'-磷酸磷酸還原酶3（APR3）（圖3c）,。除APS2外,，3個(gè)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和2個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、以及3個(gè)硫酸鹽同化酶的轉(zhuǎn)錄水平均與總Se,、SeCys2和SeO42-含量顯著相關(guān),，表明這些基因與碎米薺的Se吸收和同化高度相關(guān)，APS2的不相關(guān)性暗示著APS2的表達(dá)并不完全是由硒酸鹽處理引起的,。

圖3 假定的Se轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和同化吸收酶類的鑒定和表達(dá)特征

（a）識(shí)別的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的比例,；（b）5個(gè)假定的Se轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)特征,；（c）3個(gè)Se同化酶基因表達(dá)特征。誤差棒上的字母表示有顯著差異(ANOVA, p < 0.05).

4. 硒酸鹽處理下碎米薺中的特異DEGs以及涉及植物病原互作的DEGs

韋恩圖顯示在0.25 vs.0,、4.0vs. 0和16.0vs.0組之間重疊了234個(gè)DEGs（圖4a）,，表明這些基因均顯著響應(yīng)了硒酸鹽處理。KEGG通路富集分析顯示在這3個(gè)對(duì)比組中,，這些基因顯著富集到植物-病原互作通路（ko04626）上,，包括鈣依賴性蛋白激酶28，EF-hand鈣結(jié)合家族蛋白,，Ca2+依賴性膜結(jié)合蛋白膜聯(lián)蛋白和鈣調(diào)蛋白5這些鈣蛋白,，且均顯著下調(diào)，另外2個(gè)呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白（RBOH）基因也顯著下調(diào)（圖4b）,，富含半胱氨酸的受體樣蛋白激酶（CRK）家族和富含半胱氨酸的分泌蛋白家族的mRNAs表達(dá)也有所降低（圖4c）,。

硒酸鹽處理刺激了碎米薺硒結(jié)合蛋白1（SBP1）和缺硫誘導(dǎo)蛋白2（SDI2）的表達(dá)，并下調(diào)了2個(gè)與SDI2密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MYB28和MYB34的轉(zhuǎn)錄（圖4d）,。在不同Se處理濃度下,，與谷胱甘肽GSH代謝相關(guān)的基因的表達(dá)水平也降低了，包括谷胱甘肽γ-谷氨酰半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶1,，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶F12,，谷氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶1和谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶I（圖4d），GSH代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化表明,，在Se脅迫下碎米薺中GSH的生物合成下降,。

圖4 植物-病原互作和數(shù)個(gè)Se響應(yīng)DEGs的鑒定

（a）韋恩圖展示了3對(duì)比較組(0.25 vs. 0, 4 vs. 0, 16 vs. 0)之間重疊的DEGs數(shù)；（b）鈣依賴蛋白激酶基因,、鈣結(jié)合蛋白基因,、鈣調(diào)蛋白基因和呼吸氧化酶同系蛋白基因的表達(dá)變化熱圖；（c）富含半胱氨酸受體樣蛋白激酶基因和富含半胱氨酸的分泌蛋白基因的表達(dá)變化熱圖,；（d）硒結(jié)合蛋白1基因,，蛋白硫缺乏誘導(dǎo)2基因，轉(zhuǎn)錄因子MYB28和MYB34以及幾種谷胱甘肽相關(guān)基因的表達(dá)變化熱圖,。

5. 蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了硒酸鹽處理下碎米薺核糖體的翻譯變化

我們對(duì)所有DEPs進(jìn)行GO富集分析顯示,，葉綠素結(jié)合，質(zhì)外體和對(duì)細(xì)菌的防御響應(yīng)分別是分子功能,，細(xì)胞成分和生物學(xué)過程中DEPs富集最多的條目,，KEGG通路富集分析表明DEPs主要富集在核糖體，其次是光合作用和碳代謝（圖5a）,。硒酸鹽處理后,，許多蛋白質(zhì)在翻譯和核糖體中的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，翻譯和核糖體中的DEPs可以分為三類：蛋白質(zhì)合成因子,，大核糖體蛋白和小核糖體蛋白（圖5b）,。具體來講,，蛋白質(zhì)合成因子，包括核糖體回收因子,，真核翻譯起始因子4G-1（eIF4G1）,，真核翻譯起始因子5A-3（eIF5A3）和延伸因子1-alpha 4（eEF1A4）的表達(dá)模式均明顯改變，特別是真核翻譯起始因子（eIF）同工型4G-1和5A-3和真核延伸因子1-alpha 4（eEF1A4）與鮮重,，總Se,，SeCys2和Se（Ⅵ）含量顯著相關(guān)（圖5b）。

核糖體是所有細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成的重要細(xì)胞器,，是由大亞基和小亞基組成的核糖核蛋白復(fù)合物,，在所有生物中均具有功能和結(jié)構(gòu)保守性。數(shù)據(jù)顯示四種大的核糖體蛋白：60S RPL11-1,、60S RPL9-1,、60S RPL7-2和50S RPL12-1，以及九種小核糖體蛋白：30S RPS17,、30S RPS10,、40S RPS29、40S RPS28-1,， 40S RPS18,、40S RPS16-2、40S RPS15a-1,、40S RPS14-2和40S RPS9-1在不同濃度的硒酸鹽處理下表現(xiàn)出明顯不同的表達(dá)水平（圖5b）,，表明Se處理碎米薺會(huì)引起核糖體蛋白的響應(yīng)。PCA分析發(fā)現(xiàn),，這些核糖體蛋白與鮮重,，總Se，SeCys2和Se（Ⅵ）含量顯著相關(guān)（圖5b）,，表明它們的表達(dá)變化可能與碎米薺生長(zhǎng),，Se吸收和同化以及蛋白質(zhì)合成作用有關(guān)。

圖5 蛋白組學(xué)中DEPs的KEGG富集分析和翻譯因子和核糖體蛋白的表達(dá)模式

（a）DEPs的KEGG富集分析,；（b）蛋白質(zhì)組學(xué)分析內(nèi)的翻譯因子與核糖體蛋白的表達(dá)特征,，以及與鮮重、總Se,、SeCys和Se（Ⅵ）含量之間的Pearson’s相關(guān)分析,。箱型上的數(shù)字是Pearson’s相關(guān)系數(shù)。*和**表示顯著差異分別為p＜0.05和0.01,。

6. 硒酸鹽處理后轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)顯示翻譯后修飾和分子伴侶的基因和蛋白的表達(dá)變化

硒酸鹽處理不僅影響碎米薺的核糖體翻譯,，而且導(dǎo)致翻譯后修飾和分子伴侶的變化,。共有85個(gè)DEGs注釋到翻譯后修飾和分子伴侶,，主要分為五類：天冬氨酸蛋白酶,，伴侶蛋白，金屬蛋白,，E3泛素蛋白連接酶和含U-box結(jié)構(gòu)域的蛋白,。天冬氨酸蛋白酶廣泛分布于所有生物中，參與植物發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)加工或降解,，具有某些特殊功能,，可以響應(yīng)植物脅迫，硒酸鹽處理組中的三種天冬氨酸蛋白酶,，包括天冬氨酸蛋白酶Asp1,，天冬氨酸蛋白酶PCS1和守衛(wèi)細(xì)胞1（ASPG1）中的蛋白質(zhì)天冬氨酸蛋白酶均顯著下調(diào)，特別是16mg/L處理組中表達(dá)水平極低（圖6a）,。

四種伴侶蛋白,，即23.6 k Da熱激蛋白（HSP23.6），伴侶蛋白dnaJ3,，dnaJ10和dnaJ20,，以及四種金屬蛋白轉(zhuǎn)錄本，包括ATP依賴性鋅金屬蛋白酶FTSH 5（FTSH5）,，ATP依賴性鋅金屬蛋白酶FTSH 6 （FTSH6）,，金屬內(nèi)毒素蛋白酶1（MEP1）和金屬硫蛋白樣蛋白2型（MTP2）在響應(yīng)硒酸鹽處理后表達(dá)模式均發(fā)生顯著改變。如圖6a所示,，在硒酸鹽處理下,，HSP23.6和dnaJ20，F(xiàn)TSH6和MTP2的表達(dá)水平明顯升高,，而dnaJ3和dnaJ10,，F(xiàn)TSH5和MEP1的表達(dá)水平降低。

E3泛素蛋白連接酶（E3s）和也屬于E3s的含U盒結(jié)構(gòu)域的蛋白（UBPs）廣泛分布于生物體中,。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示了泛素蛋白和UBPs的表達(dá)變化,，除E3泛素蛋白連接酶RHA1B（以下簡(jiǎn)稱RHA1B）和泛素羧基末端水解酶12（UBP12）外，E3s和UBPs均顯著下調(diào)（圖6b）,。

蛋白質(zhì)組學(xué)分析還顯示DEPs的變化富集在翻譯后修飾,，共有29個(gè)DEPs注釋到翻譯后修飾和分子伴侶。按照翻譯后修飾中的DEGs對(duì)DEPs進(jìn)行過濾,，得到幾種DEPs（圖6c）,，在4.0和0.25 mg/L硒酸鹽處理中，ASPG2和dnaJ蛋白P58IPK同源物（以下稱為P58IPK）的表達(dá)水平略有增加,；在不同的硒酸鹽濃度處理下,，HSP70，HSP90和FTSH8的表達(dá)持續(xù)下降,；與0 mg/L組相比,，泛素DSK2b和泛素PCUBI4-2在0,、0.25和4.0 mg/L組中表達(dá)一般，在16.0 mg/L組中以1.8倍和2.9倍急劇增加至高水平,。

圖6 涉及翻譯后修飾和分子伴侶的基因和蛋白表達(dá)模式

（a）天冬氨酸蛋白酶基因,、伴侶蛋白基因和金屬蛋白基因的表達(dá)特征；（b）泛素蛋白基因和含U盒結(jié)構(gòu)域的蛋白基因的表達(dá)特征,；（c）參與翻譯后修飾和伴侶蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)特征,。Asp1：天冬氨酸蛋白酶Asp1；ASPG：保衛(wèi)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)天冬氨酸蛋白酶,；ATL31 / RHA1B / RING1 / XBAT35：E3泛蛋白連接酶ATL31 / RHA1B /RING1 / XBAT35,；FTSH：ATP依賴性鋅金屬蛋白酶FTSH；HSP：熱激蛋白,；dnaJ：伴侶蛋白dnaJ,；MEP1：金屬內(nèi)切蛋白酶1；MTP2：2類金屬硫蛋白樣蛋白,；PCS1：天冬氨酸蛋白酶PCS1,；PUB：含U-box結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；UBP12：泛素羧基末端水解酶12,。

7. 對(duì)DEGs的qRT-PCR驗(yàn)證

從DEGs中選擇60個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR,，以驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。qRT-PCR和RNA-Seq結(jié)果之間有顯著相關(guān)性,，表明RNA-Seq數(shù)據(jù)可靠,。RNA-Seq分析中的23個(gè)基因的表達(dá)水平與碎米薺的Se積累和耐受性相關(guān)，與qRT-PCR的表達(dá)水平具有顯著相關(guān)性,，進(jìn)一步證明了這些基因在響應(yīng)硒酸鹽中的作用,。

1. 碎米薺組織能耐受極高的Se含量

該研究在不同濃度硒酸鹽中水培碎米薺幼苗，與0 mg/L處理相比,，不同濃度處理下碎米薺的生長(zhǎng)有顯著差異,，具體來講，低硒酸鹽濃度（0.25 mg/L）刺激碎米薺幼苗生長(zhǎng),，高硒酸鹽濃度（16.0mg/L）抑制其生長(zhǎng)（圖1a,，b），這種現(xiàn)象表明,，低水平的硒酸鹽對(duì)植物是有益的,，而硒酸鹽水平升高會(huì)阻礙植物生長(zhǎng)。碎米薺幼苗的Se含量范圍從低處理組的120 mg/kg DW到高處理組的近10000 mg/kg DW（圖1c）,，表明碎米薺具有很強(qiáng)的Se耐受能力,；此外，碎米薺中主要Se形態(tài)是高含量的SeCys2和SeO42-，表明SeO42-被碎米薺吸收并轉(zhuǎn)化為有機(jī)Se化合物,?？紤]到碎米薺在16.0 mg/L硒酸鹽處理下受到脅迫，這意味著SeO42-的同化途徑受到嚴(yán)重影響,；有趣的是,，隨著硒酸鹽的大量涌入,，無機(jī)Se占Se總含量的比例在應(yīng)該增加的情況下卻仍在下降,，表明碎米薺可以將SeO42-轉(zhuǎn)化為其他Se形式?？傊槊姿j可以忍受高含量的組織Se,，并具有強(qiáng)大的同化硒酸鹽的能力。

2. 多個(gè)Se轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和同化酶的高表達(dá)有助于碎米薺的Se累積

植物通過硫代謝通路吸收和同化Se,，之前有研究證明硫酸鹽在Sultr1;1和Sultr1;2的介導(dǎo)下進(jìn)入擬南芥根部,。SULTR2;1是一種低親和力的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，位于維管組織中,，參與硫酸鹽向木質(zhì)部薄壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn),。在不同濃度的硒酸鹽處理下Sultr1;1、Sultr1;2和Sultr2;1顯著上調(diào),，與碎米薺Se含量高度相關(guān),，因此，Sultr1;1,、Sultr1;2和Sultr2;1的高表達(dá)是碎米薺大量累積硒酸鹽的主要原因,。

在硒酸鹽處理下，兩種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCF5和ABCG40也上調(diào)表達(dá),，且與碎米薺Se含量高度相關(guān),。在擬南芥中，ABCG40位于質(zhì)膜上并起泵作用,，從細(xì)胞質(zhì)中排除含有毒性化合物的Pb（II）或Pb（II）,，目前對(duì)ABCF5的研究還不太完善，由于ABCF3和ABCF4位于擬南芥的胞質(zhì)溶膠中,，因此推測(cè)ABCF5也可能位于胞質(zhì)溶膠中,；因此，Se或含Se的化合物可以被ABCF5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中,，并被膜蛋白ABCG40從細(xì)胞中排除到周質(zhì)中,。

隨著硒酸鹽濃度的增加，APS2,，APR1和APR3顯著上調(diào),。作為硒酸鹽還原途徑中的第一個(gè)酶，APS催化硒酸鹽與ATP偶聯(lián)形成5'-磷酸亞硒酸腺苷（APSe）；為增加Se的積累,，已將APS作為植物基因工程的目標(biāo),；APR介導(dǎo)APSe轉(zhuǎn)化為亞硒酸鹽，APR還通過增強(qiáng)無機(jī)Se向有機(jī)形式的轉(zhuǎn)化以及清除活性氧（ROS）,，來增強(qiáng)植物體的Se耐受性,。綜上所述，APS2,、APR1和APR3的上調(diào)不僅可能促進(jìn)硒酸鹽從無機(jī)到有機(jī)形式的轉(zhuǎn)化,，但也增強(qiáng)了小葉錦葵中Se的積累和耐受性。

3. 碎米薺耐受Se的潛在機(jī)制

碎米薺有各種響應(yīng)方式以適應(yīng)硒酸鹽環(huán)境,。該研究中一系列鈣傳感器蛋白基因,，包括鈣依賴性蛋白激酶（CDPKs），鈣結(jié)合蛋白和鈣調(diào)蛋白,，以及兩個(gè)注釋為RBOH的轉(zhuǎn)錄本,，均在硒酸鹽處理下下調(diào)（圖4）。CDPK是植物中鈣傳感器的最大家族之一,；植物RBOH蛋白包含鈣結(jié)合EF-hand和負(fù)責(zé)產(chǎn)生超氧化物的功能性氧化酶結(jié)構(gòu)域,；StCDPK4和StCDPK5可以磷酸化NADPH氧化酶，從而正向調(diào)節(jié)馬鈴薯中ROS的產(chǎn)生,；此外,，鈣在程序性細(xì)胞死亡的激活中充當(dāng)下游氧化爆發(fā)的信號(hào)，因此,，當(dāng)碎米薺吸收大量硒酸鹽時(shí),，鈣傳感器蛋白和RBOH的下調(diào)可能會(huì)降低ROS的產(chǎn)生，維持細(xì)胞均勻性并干擾程序性細(xì)胞死亡,，這是碎米薺耐受Se的有效策略,。

富含半胱氨酸的受體樣激酶（CRKs）是最大的受體樣激酶家族之一，具有46個(gè)成員,，其特征是含有豐富的半胱氨酸,，在應(yīng)激反應(yīng)和抗真菌活性中起作用。擬南芥AtCRK4,、AtCRK5,、AtCRK19和AtCRK20的過度表達(dá)會(huì)激活超敏反應(yīng)，包括細(xì)胞死亡,，而在本研究硒酸鹽處理下,，碎米薺的CRK均被下調(diào)（圖4c），表明其在極高的Se含量下有助于防止植物的超敏反應(yīng)和細(xì)胞死亡,；另外,，CRK表達(dá)的降低減少了SeCys取代摻入CRK蛋白中的Cys的可能,，進(jìn)一步減少了某些功能蛋白的形成以減輕Se的毒性。

過表達(dá)SBP1的缺硫擬南芥中GSH含量下降,，卻對(duì)Se（Ⅵ）的耐受顯著增強(qiáng),，表明SBP1的表達(dá)降低了耐脅迫過程中對(duì)GSH的需求。已有研究證明SBP1與亞硒酸鹽孵育后,，SBP1以1：1比例與Se結(jié)合為R-S-Se（II）-S-R絡(luò)合物,，本研究中碎米薺中SBP1的上調(diào)表達(dá)和GSH相關(guān)基因的下調(diào)（圖4d）表明SBP1降低了硒酸鹽的敏感性，并在耐受Se中起重要作用,；此外,，SDI2的表達(dá)也顯著增強(qiáng)，而MYB28和MYB34卻下調(diào),，SDI2是控制缺硫條件下擬南芥中芥子油苷（GSL）生物合成的主要阻遏物,；而GSLs是十字花科植物中富含硫的次生代謝產(chǎn)物,；MYB28和MYB34又被認(rèn)為是GSL生物合成的主要正調(diào)節(jié)劑,，因此SDI2的表達(dá)增強(qiáng)，以及MYB28和MYB34的下調(diào),，減少了GSL的生物合成,，并導(dǎo)致硫在碎米薺中得以留存；且代謝組中GSL生物合成的兩個(gè)前體L-色氨酸和吲哚也被下調(diào)表達(dá)（圖2c）,。綜上所述,，SBP1的上調(diào)降低了碎米薺對(duì)Se的敏感性，而GSH相關(guān)基因,，MYB28和MYB34的下調(diào)以及SDI2的上調(diào),，共同促進(jìn)了硫損失的減少，從而增強(qiáng)了碎米薺的Se耐受性,。

4. 推測(cè)的碎米薺的Se解毒機(jī)制

本研究中,，硒酸鹽處理顯著改變了碎米薺中eIFiso4G1，eIF5A-3和eEF1A4的表達(dá)（圖5）,。eIFiso4G屬于eIF4家族,，可以促進(jìn)或抑制特定mRNA的翻譯；據(jù)報(bào)道,，與正常植物相比,，eIFiso4G缺失的擬南芥突變體表現(xiàn)出較小的細(xì)胞，葉片和植物大??；eIF5A似乎起著核-胞質(zhì)穿梭蛋白的作用，將特定的mRNAs從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì),；eEF1A4對(duì)蛋白質(zhì)合成很重要,，可以作為分子伴侶增強(qiáng)擬南芥中的NaCl耐受性。綜上所述，eIFiso4G1,，eIF5A-3和eEF1A4與鮮重,，總Se，SeCys2和Se（Ⅵ）含量之間的高相關(guān)系數(shù)（圖5）表明這些翻譯因子與碎米薺的Se耐受性密切相關(guān),，但這些翻譯因子在碎米薺的Se耐受中的作用仍需進(jìn)一步確認(rèn),。

核糖體是由大亞基和小亞基組成的核糖核蛋白復(fù)合物，在真核生物/原核生物中,，大亞基和小亞基也分別稱為60S / 50S和40S / 30S亞基,。RPs調(diào)節(jié)特定轉(zhuǎn)錄本的翻譯和某些葉片發(fā)育過程，例如,，擬南芥RPL27aC缺陷型胚胎發(fā)育遲緩,。此外，有報(bào)道指出RP mRNAs的表達(dá)變化表示蛋白質(zhì)合成中的常規(guī)和細(xì)微調(diào)節(jié),，使植物能夠在動(dòng)態(tài)環(huán)境中生存,。本研究中RPs以及翻譯因子的表達(dá)變化可能會(huì)改變碎米薺的蛋白質(zhì)合成，考慮到硒酸鹽處理下碎米薺中的高SeCys2含量,，可以合理地推測(cè)蛋白質(zhì)合成的變化會(huì)減少某些容易與SeCys摻入的蛋白質(zhì)的合成,。因此這可能是碎米薺避免Se中毒的一種積極應(yīng)對(duì)方法。

為了應(yīng)對(duì)Se脅迫,，有的高累積植物會(huì)調(diào)節(jié)翻譯后活性,，例如E3泛素連接酶，分子伴侶,，金屬結(jié)合蛋白,。E3的主要功能是調(diào)節(jié)靶蛋白的多泛素化和隨后的降解，而本研究中翻譯后修飾過程中相應(yīng)的DEG和DEP發(fā)生變化（圖6）,；HSP23.6屬于小型熱激蛋白20（sHSP20）家族,，在植物的抗逆性中發(fā)揮作用，例如干旱和熱脅迫,，而dnaJ20是70 kDa熱激蛋白（HSP70）伴侶系統(tǒng)的一部分,；分子伴侶在不同細(xì)胞進(jìn)程中蛋白質(zhì)的折疊、組裝,、翻譯和降解中發(fā)揮作用,。因此，HSP23.6和dnaJ20的上調(diào)表達(dá)表明其可能參與解決硒酸鹽處理下碎米薺中功能異常和折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì),。在擬南芥中,，已知FTSH蛋白酶在管內(nèi)蛋白膜蛋白的分解中具有重要功能，而該研究中FTSH6的上調(diào)表達(dá)表明它可能參與了與SeCys結(jié)合的某些膜蛋白的降解,。金屬硫蛋白（MTs）可以結(jié)合金屬離子,，從而增加植物對(duì)金屬的耐受性,，碎米薺MTP2的表達(dá)增強(qiáng)表明MTP2可能與Se結(jié)合并減輕氧脅迫。RHA1B是一種E3泛素連接酶,，可催化富含核苷酸的亮氨酸重復(fù)免疫受體的降解,，并抑制馬鈴薯孢囊線蟲的超敏反應(yīng)。UBP12是與蛋白降解有關(guān)的泛素蛋白,，RHA1B和UBP12的表達(dá)上調(diào),，表明它們可能參與了碎米薺功能障礙蛋白的降解。

5. 碎米薺耐受和累積Se的機(jī)制

基于以上分析,，我們提出了碎米薺耐受和累積Se的假設(shè)機(jī)制（圖7）：在根部,，Sultr1; 1和Sultr1; 2從周圍環(huán)境中導(dǎo)入SeO42-，而Sultr2; 1則介導(dǎo)SeO42-進(jìn)入芽中,，在葉片中,，SeO42-可通過APS，APR1和ARP3的作用同化為SeCys,；細(xì)胞質(zhì)溶膠中的部分Se可被細(xì)胞質(zhì)中的ABCF5轉(zhuǎn)運(yùn),，被ABCG40從細(xì)胞中排除，并沉積在葉片邊緣,；SBP1的上調(diào)導(dǎo)致GSH降低,，而SDI2的上調(diào)與MYB34和MYB28的下調(diào)相結(jié)合導(dǎo)致GSL的生成減少,，有助于保留硫以滿足初級(jí)硫需求,；CRKs的下調(diào)將減少SeCys取代摻入CRK蛋白中的Cys的機(jī)會(huì)，并進(jìn)一步減少某些故障蛋白的形成,，從而減輕Se毒性,；CDPK和CML的下調(diào)將導(dǎo)致ROS降低，這與硫的殘留一起可以抑制超敏反應(yīng),，并進(jìn)一步抑制碎米薺的程序性細(xì)胞死亡（PCD）,，這將是碎米薺耐受Se的有效途徑。核糖體可以減少某些蛋白質(zhì)的合成,，而伴侶蛋白和泛素蛋白質(zhì)可以幫助降解某些錯(cuò)誤和功能異常的蛋白質(zhì),，因此，硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,，硒同化酶,，PCD抑制和無序蛋白的降解一起導(dǎo)致了碎米薺中Se的過度積累和耐受。而CRKs,、CDPK和CML的下調(diào)進(jìn)一步增強(qiáng)碎米薺的Se耐受性,，這一新發(fā)現(xiàn)的機(jī)制目前還未在其他Se超累積植物中被提出。

圖7 碎米薺假定的Se耐受和累積機(jī)制示意圖

ABCF5：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白F家族成員5,；ABCG40：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G家族成員40,；APS：三磷酸腺苷硫酸化酶,；APR：腺苷5'-磷酸磷酸還原酶；Asp：天冬氨酸蛋白酶,；CDPK：鈣依賴性蛋白激酶,；CML：鈣調(diào)蛋白樣蛋白；CRK：富含半胱氨酸的受體樣激酶,；dnaJ：伴侶蛋白dnaJ,；GSH：谷胱甘肽；HSP：熱激蛋白,；MTP：類金屬硫蛋白,；MYB：成績(jī)單因子MYB；SBP1：硒結(jié)合蛋白1,；SDI2：蛋白硫缺乏誘導(dǎo)2,；PUB：含U-box結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；ROS：活性氧,；SeCys：硒代半胱氨酸,；Sultr：硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；Ub：泛素蛋白連接酶,。