目前人類基因組大概有2萬(wàn)多個(gè)基因,，大約有80%都在腦內(nèi)表達(dá)。目前的遺傳性疾病中,，有超過(guò)5000種是已知其分子改變基礎(chǔ),。其中有40%累及大腦或神經(jīng)系統(tǒng)。以往采取的是第一代測(cè)序技術(shù)，只能在PCR擴(kuò)增基因后才能測(cè)序,，通量小,，測(cè)序成本高，數(shù)據(jù)分析量大,，無(wú)法完成全基因組層面的分析,，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，臨床使用受到限制,。而目前第二代測(cè)序技術(shù)逐漸在臨床中得以應(yīng)用,。其在很短時(shí)間內(nèi)能完成上百億個(gè)堿基對(duì)的測(cè)序,，高通量,，低成本，自動(dòng)化程度高,，是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的一次革命性的改變,，為神經(jīng)科精準(zhǔn)治療提供了強(qiáng)大的武器支持。

全外顯子測(cè)序

      全外顯子測(cè)序是主要測(cè)定基因的負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)編碼的部分,，只占整個(gè)基因組堿基對(duì)的1-2%,，然而，卻集中了目前遺傳性疾病的絕大部分已知突變,。全外顯子測(cè)序可以診斷幾乎全部神經(jīng)科不同種類的遺傳性疾病,。采用全外顯子基因技術(shù)可一次監(jiān)測(cè)超過(guò)5000種神經(jīng)科不同基因型的疾病。其原理是采用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域的DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法,，是一種選擇基因組序列的高效方法,。其試驗(yàn)流程是：基因組DNA制備和檢測(cè)→構(gòu)建片段文庫(kù)→目標(biāo)片段的富集→富集文庫(kù)的擴(kuò)增→文庫(kù)質(zhì)量的檢測(cè)→高通量測(cè)序

      全外顯子測(cè)序的在神經(jīng)科不同疾病的陽(yáng)性診斷率

變異的識(shí)別和篩選

    不同于第一代測(cè)序技術(shù)，二代測(cè)序技術(shù)需要復(fù)雜大量的生物學(xué)計(jì)算過(guò)程,。目前所采用的參考基因組來(lái)源于13個(gè)匿名的捐贈(zèng)者,，病人的基因和參考基因做排列對(duì)比，任何與參考基因不同的變異都會(huì)標(biāo)注,，從而產(chǎn)生一個(gè)變異列表,。平均外顯子檢測(cè)可以檢測(cè)出30000個(gè)變異，而全基因組檢測(cè)可以檢測(cè)出幾百萬(wàn)個(gè)變異,。這幾萬(wàn)個(gè)變異不一定都與臨床疾病相關(guān),。所以測(cè)序后還需進(jìn)行變異的識(shí)別和篩選，篩選出真正可能和疾病相關(guān)的變異,。

      進(jìn)行篩選的第一步就是和健康人群對(duì)照相比對(duì),。我們可以假設(shè)健康人群對(duì)照者中出現(xiàn)致病變異的幾率很低或者基本沒(méi)有。所以我們要對(duì)比這個(gè)變異在正常人群中出現(xiàn)的幾率,。一般當(dāng)這種變異的突變幾率在正常人群中超過(guò)1%,，就可以認(rèn)為這種變異屬于基因多態(tài)性，一般不具有致病性。當(dāng)變異在正常人群中小于0.1%,，這種變異可能為致病變異,。對(duì)于這種健康人群數(shù)據(jù)比對(duì)，西方國(guó)家已經(jīng)建立了多個(gè)基因數(shù)據(jù)庫(kù),，存放了數(shù)萬(wàn)名受檢者的海量基因信息,，可以提供變異比對(duì)的服務(wù)。

 基因變異的臨床解釋

       基因變異的臨床解釋非常重要,。測(cè)試出的臨床變異和臨床表現(xiàn)有無(wú)必然的聯(lián)系非常重要,。錯(cuò)誤的解釋可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，因此臨床解釋必須非常嚴(yán)格,。比如,，在一些癌癥的領(lǐng)域，錯(cuò)誤的解釋可能導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)氖中g(shù)策略和監(jiān)測(cè)措施,。在日常工作中,，只有認(rèn)為基因變異確定與臨床表現(xiàn)存在聯(lián)系才能報(bào)告。

     一般來(lái)說(shuō),，臨床解釋總是以突變頻率評(píng)估作為開始,，但是單純依賴突變頻率也可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。比如,，遺傳性痙攣性截癱被認(rèn)為是與SPG7基因變異相關(guān),。在這個(gè)基因上的一種突變1529C→T按照在人群的突變頻率可以被解釋為基因多態(tài)性，然而,，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù),，這個(gè)變異還是和遺傳性痙攣性截癱的表型相關(guān)，表明這一突變是致病性的,。

    西方國(guó)家推出了一些關(guān)于基因變異臨床解釋的共識(shí)和指南,。這些共識(shí)和指南中包括的內(nèi)容有：表型的詳細(xì)資料，遺傳方式,，突變機(jī)制,，蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，在文獻(xiàn)和人群中基因和疾病關(guān)聯(lián)的證據(jù)等等,。突變按照此分類為：致病突變,，可能致病突變，意義未確定,，可能非致病突變,，非致病突變。

全外顯子檢測(cè)的局限性

       在神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病中,，表型和基因測(cè)序的診斷符合率不到40%,。有以下一些原因,。首先一點(diǎn)，一些被認(rèn)為是遺傳性疾病的患者其實(shí)是獲得性的一些疾病,。其次,，是全外顯子測(cè)序技術(shù)上的原因。測(cè)序覆蓋的深度不完全,，捕獲效率低,，存在問(wèn)題的基因本身是比較難測(cè)序的區(qū)域，比如富含GC的區(qū)域等等,。第三,，一些突變類型，比如重復(fù)擴(kuò)增,，復(fù)合拷貝數(shù)量突變,，引起染色體結(jié)構(gòu)異常的突變等等，很難通過(guò)全外顯子檢測(cè)來(lái)識(shí)別,。需要一些特殊的檢測(cè)手段,。第四,，發(fā)生在非編碼區(qū),，也就是發(fā)生在非外顯子區(qū)域的突變也不能通過(guò)全外顯子檢測(cè)來(lái)檢測(cè)。

基于二代測(cè)序的基因靶向測(cè)序

     為了提升效率和減少成本,，基因靶向測(cè)序就是在二代測(cè)序基礎(chǔ)上,，重點(diǎn)關(guān)注最有可能和疾病或表型相聯(lián)系的基因。最初的手段是捕獲比較感興趣的基因區(qū)域,，目前的手段是采用檢測(cè)板檢測(cè)的方法,。這種方法是整個(gè)基因都被測(cè)序，但只有實(shí)驗(yàn)室制備的特異性的檢測(cè)板的基因才會(huì)被分析,。這種方法的優(yōu)勢(shì)就是提升了測(cè)序的性價(jià)比,。從臨床上說(shuō)，這種方法也避免了臨床過(guò)度分析無(wú)關(guān)基因突變的意義,。

全基因組測(cè)序

    一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開始全基因組測(cè)序從而代替全外顯子測(cè)序,。全基因組測(cè)序檢測(cè)全部30億個(gè)堿基對(duì)，包括外顯子區(qū)和非編碼區(qū),。而全外顯子測(cè)序只檢測(cè)占全部基因組1%的編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域,。外顯子是基因組中重要的核心功能區(qū)域，而不編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域過(guò)去被認(rèn)為不發(fā)揮任何作用,。越來(lái)越多的證據(jù)表明非編碼區(qū)對(duì)外顯子功能起重要的調(diào)控作用,。

  全基因組測(cè)序有很多優(yōu)點(diǎn)。 引起對(duì)于多代基因異常,，或者涉及基因調(diào)節(jié)異常,，比如轉(zhuǎn)錄異常等等,，全基因組測(cè)序有重要的作用。對(duì)于單純外顯子測(cè)序難以檢測(cè)的突變,，比如染色體結(jié)構(gòu)改變,，拷貝數(shù)量突變等等，有更高的敏感性,。

   盡管全基因組檢測(cè)有很多優(yōu)點(diǎn),，但是此項(xiàng)檢測(cè)的變異多位于非編碼區(qū)或內(nèi)含子區(qū)，都是基因調(diào)控表達(dá)的區(qū)域,。這些位置的變異很難評(píng)估是否與臨床表型相關(guān)聯(lián),。可能需要補(bǔ)充RNA轉(zhuǎn)錄的數(shù)據(jù)分析,。

     遺傳病的基因診斷策略

    醫(yī)學(xué)的發(fā)展薪火相傳,。從遠(yuǎn)古的癥狀水平，逐步發(fā)展為解刨水平,，影像,，電生理水平，再到后來(lái)的細(xì)胞,，蛋白水平,，目前已經(jīng)走進(jìn)了基因水平。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的大幕正在徐徐拉開,，為今后疾病的診斷和治療提供了更大的舞臺(tái),。更多的檢測(cè)手段，更好的技術(shù),，為今后基因治療的發(fā)展提供了更大的可能性,。逆水行走，大浪淘沙,，神經(jīng)科醫(yī)生,，我們做好了在這片舞臺(tái)上起舞的準(zhǔn)備了嗎？

參考文獻(xiàn)：

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