摘要

      雖然臨床醫(yī)生通過(guò)診斷性實(shí)驗(yàn)室（遺傳檢測(cè)機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室）所提供的新的遺傳學(xué)技術(shù)如二代測(cè)序及染色體芯片等極大地提高了對(duì)遺傳性腎臟病的診斷,，然而,，要做到精準(zhǔn)診斷此類(lèi)疾病，首先需要臨床醫(yī)生能識(shí)別出可能的此類(lèi)疾病患者,，然后在熟知各種遺傳檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上依據(jù)患者表型選擇恰當(dāng)?shù)姆肿釉\斷技術(shù)手段和合適的組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),，獲得的遺傳檢測(cè)報(bào)告需結(jié)合患者的表型、可能的遺傳模式以及共識(shí)指南等進(jìn)行臨床解讀,，與此同時(shí)發(fā)揮研究性實(shí)驗(yàn)室功能,，通過(guò)應(yīng)病而設(shè)的技術(shù)方法解決診斷性實(shí)驗(yàn)室無(wú)法解決的特殊問(wèn)題，最終為患者及其家庭提供精準(zhǔn)診治意見(jiàn),。

遺傳性腎臟病廣義上是指由于遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能改變所導(dǎo)致的腎臟疾?。华M義上則指由于遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能改變所致,、按一定方式垂直傳遞,、后代中常常表現(xiàn)出一定發(fā)病比例的腎臟疾病。此類(lèi)疾病按照遺傳病的分類(lèi)可分為染色體病,、單基因病,、多基因病、線粒體病和體細(xì)胞遺傳病,，按照累及腎臟部位分為腎小球病,、腎小管病、腎小管間質(zhì)病,、腎血管病,、腎臟尿路畸形、腎囊腫和腎臟腫瘤,。

自遺傳學(xué)進(jìn)入腎臟病領(lǐng)域的近40年里,，遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展帶動(dòng)并促進(jìn)了對(duì)遺傳和腎臟疾病關(guān)系的認(rèn)識(shí),，且實(shí)現(xiàn)了對(duì)遺傳性腎臟病的分子診斷,。研究顯示，遺傳性腎臟病是成人慢性腎臟病最嚴(yán)重階段終末期腎病五大常見(jiàn)原因之一,，約占25歲前起病的慢性腎臟病患者的20%，占兒童腎移植患者的30%,可見(jiàn)遺傳性腎臟病并不罕見(jiàn),。然而,，此類(lèi)疾病種類(lèi)繁多，起病隱匿,，臨床表現(xiàn)常不特異,，甚至直至進(jìn)展至終末期腎病時(shí)才被發(fā)現(xiàn)，因此早期,、及時(shí)確切的診斷此類(lèi)疾病成為亟待解決的臨床問(wèn)題,。新的遺傳學(xué)技術(shù)如二代測(cè)序和基因芯片在臨床實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用,，提高了臨床醫(yī)生對(duì)遺傳性腎臟病的診斷，但由此也產(chǎn)生了一系列問(wèn)題,，如哪些腎臟病需要分子診斷,，如何選擇合適的遺傳檢測(cè)方案，如何基于臨床對(duì)診斷性實(shí)驗(yàn)室出具的遺傳檢測(cè)報(bào)告進(jìn)行解讀等,。顯然這些問(wèn)題的解決是做到精準(zhǔn)診斷遺傳性腎臟病的關(guān)鍵一步,，需要臨床醫(yī)生在提高對(duì)遺傳性腎臟病識(shí)別力的基礎(chǔ)上，掌握并及時(shí)更新遺傳學(xué)知識(shí),，且與專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)專(zhuān)家,、生物信息學(xué)家、遺傳學(xué)家合作,，充分發(fā)揮研究性實(shí)驗(yàn)室作用,，進(jìn)而為每一位患病個(gè)體及所在家庭的精準(zhǔn)診斷、客觀遺傳咨詢(xún)提供科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊罁?jù),。

一,、分子診斷的適應(yīng)證

遺傳檢測(cè)的診斷價(jià)值僅限于具有遺傳病因的疾病。也就是說(shuō),，遺傳檢測(cè)適用于腎臟科醫(yī)生依據(jù)專(zhuān)業(yè)知識(shí)高度懷疑某種腎臟病為遺傳病,。然而，如果將遺傳檢測(cè)作為除外某種腎臟病系遺傳原因所致則是不合適的,。

詳細(xì)地收集表型（包括病史,、體格檢查、生化檢查,、腎組織病理檢查,、影像學(xué)檢查以及家族史調(diào)查）對(duì)判斷腎臟病有無(wú)遺傳病因必不可少。相當(dāng)數(shù)量的遺傳性腎臟病在兒童期甚至嬰兒期,、胎兒期就出現(xiàn)癥狀,，因此起病年齡早，特別是當(dāng)臨床對(duì)某種腎臟病診斷不清楚時(shí)往往被作為懷疑遺傳病的依據(jù)之一,。伴有腎外表現(xiàn)的腎臟病,、雙側(cè)先天性腎臟尿路畸形、對(duì)包括激素在內(nèi)的多種免疫抑制劑都耐藥的腎病綜合征以及有家族聚集現(xiàn)象的腎臟病均提示遺傳病的可能,。依據(jù)腎活檢組織的特異性病理改變及一些生化檢查如血乳酸水平,、半乳糖苷酶α活性等可明確診斷某些腎臟病為遺傳病。然而值得注意的是,，對(duì)于小家系,、呈常染色體隱性遺傳的腎臟病和新發(fā)變異引起的腎臟病而言，通常缺乏家族史,；遺傳性腎臟病臨床表現(xiàn)多樣,，而腎臟科醫(yī)生關(guān)于此類(lèi)疾病的認(rèn)識(shí)往往基于小樣本患者,，且此類(lèi)疾病的兒童患者可能尚未表現(xiàn)出有診斷價(jià)值的癥狀或腎臟病理改變，臨床中采用的確診方法非標(biāo)準(zhǔn)化等,，造成臨床醫(yī)生很難判斷某種腎臟病是否為遺傳病,，從而借助遺傳檢測(cè)尋找病因，而比較低的遺傳檢測(cè)陽(yáng)性率則會(huì)誤導(dǎo)臨床醫(yī)生放棄遺傳性腎臟病的診斷,。

此外,，改善全球腎臟病預(yù)后組織在2017年活體供腎者的評(píng)估與護(hù)理指南指出，潛在活體供腎者患有導(dǎo)致腎衰竭的遺傳性腎臟病時(shí)不可以作為捐獻(xiàn)者,。因此,，建議潛在活體供腎者進(jìn)行遺傳檢測(cè)，一則可以指導(dǎo)供體選擇,，再則有助于判斷腎臟預(yù)后,。

二、遺傳檢測(cè)方案的選擇

目前在臨床實(shí)踐中用于分子診斷遺傳性腎臟病的檢測(cè)方法主要是基于基因組DNA水平的分析,，而基于目標(biāo)基因mRNA水平及編碼蛋白水平的分析極少,。

基于基因組DNA水平的檢測(cè)方法大到可以檢測(cè)染色體核型，小到可以檢測(cè)基因中單個(gè)堿基的改變,。目前常用的遺傳檢測(cè)方案包括對(duì)基因變異的檢測(cè)和對(duì)拷貝數(shù)變異的檢測(cè),。其中對(duì)基因變異的檢測(cè)通過(guò)一代測(cè)序和二代測(cè)序，二代測(cè)序又包括目標(biāo)序列靶向捕獲測(cè)序,、全外顯子組測(cè)序和全基因組測(cè)序,；對(duì)拷貝數(shù)變異的檢測(cè)主要通過(guò)染色體微陣列分析。國(guó)內(nèi)外已有文章就上述遺傳檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),、缺點(diǎn)及適用范圍進(jìn)行了詳細(xì)的論述,。遺傳檢測(cè)方案的選擇必須基于患者的臨床表現(xiàn)，因此要求對(duì)患者進(jìn)行深入細(xì)致的臨床評(píng)估,。如果所懷疑的遺傳性腎臟病致病基因僅1個(gè)或幾個(gè),，可以選擇一代測(cè)序或特定疾病目標(biāo)序列靶向捕獲測(cè)序，如果因多器官畸形而懷疑基因組病則選擇染色體微陣列分析,，如果臨床評(píng)估無(wú)定論但又高度懷疑遺傳性腎臟病,、表型具有高度遺傳異質(zhì)性或特定疾病目標(biāo)序列靶向捕獲測(cè)序結(jié)果陰性時(shí)可選擇孟德?tīng)栠z傳病目標(biāo)序列靶向捕獲測(cè)序、全外顯子組測(cè)序或全基因組測(cè)序,。

三,、遺傳檢測(cè)報(bào)告的臨床解讀

盡管目前診斷性實(shí)驗(yàn)室出具的遺傳檢測(cè)報(bào)告依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics，ACMG）2015年"序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南"并結(jié)合人群與疾病數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息分析工具對(duì)變異進(jìn)行了分級(jí)與評(píng)價(jià),，但是并不能直接用于臨床診斷，還必須評(píng)估變異是否與患者的臨床表現(xiàn)一致,。臨床醫(yī)生在對(duì)一份遺傳檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行有關(guān)變異致病性,、遺傳方式及與疾病關(guān)系的解讀時(shí)需注意以下特殊情況,。

1．致病性變異判斷方面：

（1）當(dāng)全外顯子組或目標(biāo)序列靶向捕獲測(cè)序檢測(cè)報(bào)告提示結(jié)果陰性，然而臨床高度懷疑腎臟病與某個(gè)單基因有關(guān)時(shí),，要考慮到基因深部?jī)?nèi)含子和非翻譯區(qū)的變異,。目前全外顯子組或目標(biāo)序列靶向捕獲測(cè)序僅檢測(cè)分析與外顯子交界20個(gè)堿基左右的內(nèi)含子區(qū)域，無(wú)法覆蓋深部?jī)?nèi)含子,，而非翻譯區(qū)的變異在數(shù)據(jù)初始分析時(shí)往往被過(guò)濾掉,。由于目前對(duì)非編碼區(qū)的研究較少，可供參考的注釋數(shù)據(jù)不多,，若懷疑上述位置存在致病性變異時(shí),，需要同時(shí)進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，可以提取能表達(dá)待檢測(cè)基因的組織RNA進(jìn)行深度測(cè)序,，或?qū)?/span>RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行一代測(cè)序,，從而明確非編碼區(qū)是否存在致病性變異。（2）往往認(rèn)為同義變異不會(huì)導(dǎo)致所編碼氨基酸的改變,，因此多數(shù)同義變異在分析數(shù)據(jù)時(shí)會(huì)被過(guò)濾掉,，僅有位于外顯子首位或末位的同義變異因有可能影響剪接而被關(guān)注；而在評(píng)價(jià)錯(cuò)義變異的影響時(shí)會(huì)綜合參考編碼氨基酸的進(jìn)化保守性,、正常及疾病人群數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)的結(jié)果,。然而已有研究顯示，非外顯子首末位的同義和錯(cuò)義變異也可以改變剪接位點(diǎn),，影響mRNA的生成,。一些功能預(yù)測(cè)軟件如Human Splicing Finde、MutPred和MaxEntScan可以預(yù)測(cè)變異對(duì)剪接的影響,，但預(yù)測(cè)的效能及準(zhǔn)確性有限,，可以通過(guò)體外微小基因?qū)嶒?yàn)?zāi)M體內(nèi)剪接過(guò)程，對(duì)臨床意義不明的同義,、錯(cuò)義變異功能進(jìn)行分析,。（3）雖然剪接位點(diǎn)變異在ACMG證據(jù)等級(jí)中被分為無(wú)功能變異（極強(qiáng)致病性變異證據(jù)），但一定需要通過(guò)RNA或蛋白質(zhì)功能分析確認(rèn),；當(dāng)剪接位點(diǎn)變異導(dǎo)致框內(nèi)缺失或插入,，使得蛋白質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域得到保留，那么證據(jù)等級(jí)會(huì)因此降低（中等致病性變異證據(jù)）,。

2．家系共分離分析確定變異來(lái)源并判斷是否符合預(yù)期的遺傳模式：

（1）新發(fā)變異是指子代基因組中存在的不同于父母基因組的變異,，一般來(lái)自父母生殖腺嵌合（精子或卵子）或受精卵發(fā)育過(guò)程中的自發(fā)變異。判定新發(fā)變異患兒的父母下一胎再患病概率時(shí),，需要考慮到父母生殖細(xì)胞嵌合體的存在,，這類(lèi)患者再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)取決于變異在生殖細(xì)胞發(fā)生的時(shí)間及變異細(xì)胞的比率。（2）非經(jīng)典孟德?tīng)栠z傳現(xiàn)象如單親二體,。單親二體是指同源染色體或染色體上的部分片段均來(lái)源于父母中的一方,，是卵子或精子形成期間或者是在胎兒早期發(fā)育中發(fā)生的隨機(jī)事件,，發(fā)病率較低，約為1/3 500,。單親二體可導(dǎo)致隱性基因發(fā)生純合變異,。因單親二體導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳病呈非經(jīng)典的孟德?tīng)栠z傳模式，隱性致病基因僅來(lái)自父母一方,；由于單親二體是隨機(jī)事件,，因此下一胎再患病概率小，在解讀基因報(bào)告和進(jìn)行遺傳咨詢(xún)時(shí)應(yīng)引起注意,。（3）考慮常染色體隱性遺傳性腎臟病的先證者通過(guò)靶向二代測(cè)序或一代測(cè)序檢測(cè)到致病基因純合變異,，而父母外周血DNA經(jīng)一代測(cè)序或定量PCR分析卻僅在一方找到相應(yīng)位點(diǎn)的雜合變異時(shí)，應(yīng)考慮到潛在的遺傳病理機(jī)制,，包括點(diǎn)突變伴重疊區(qū)域外顯子大片段缺失,、單親二體、生殖細(xì)胞嵌合,、新發(fā)變異和等位基因脫扣,。

3．分析表型特點(diǎn)與序列變異關(guān)系時(shí)需要注意：

（1）外顯不全，并不是所有含顯性致病基因致病性變異的個(gè)體都出現(xiàn)臨床表現(xiàn),，這可能和生長(zhǎng)發(fā)育,、年齡和性別相關(guān)。（2）表現(xiàn)度差異,，致病基因可引起不同患兒臨床表現(xiàn)及嚴(yán)重程度不同,。

四、研究性實(shí)驗(yàn)室助力精準(zhǔn)診斷遺傳性腎臟病

遺傳性腎臟病精準(zhǔn)診斷需要團(tuán)隊(duì)合作,，需要臨床醫(yī)生,、分子遺傳學(xué)家、診斷性實(shí)驗(yàn)室和研究性實(shí)驗(yàn)室的專(zhuān)家保持密切的溝通和合作,，最好定期共同就每例進(jìn)行遺傳檢測(cè)的患者予以"剝絲抽繭"分析和討論,。

診斷性實(shí)驗(yàn)室無(wú)法解決上述提及的遺傳檢測(cè)報(bào)告臨床解讀注意的特殊情況，而研究性實(shí)驗(yàn)室則可有機(jī)地結(jié)合患兒,、應(yīng)疾病需要而設(shè)實(shí)驗(yàn)方案,，對(duì)特殊問(wèn)題進(jìn)行求證、解決,。常染色體隱性遺傳病由位于同源染色體等位基因的純合或復(fù)合雜合致病性變異引起,，而真正的純合變異更可能發(fā)生在近親婚配的家庭中。北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科近期一項(xiàng)研究顯示^[15],，6例來(lái)自非近親婚配家庭的患有常染色體隱性遺傳性腎臟病的先證者發(fā)現(xiàn)"特殊"純合變異,，即先證者通過(guò)二代測(cè)序或一代測(cè)序檢測(cè)到致病基因純合變異，但經(jīng)驗(yàn)證后僅在父母一方發(fā)現(xiàn)相同變異，顯然這與傳統(tǒng)的孟德?tīng)栠z傳規(guī)律不符,，很難對(duì)先證者同胞復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)作出準(zhǔn)確評(píng)估,。而在研究性實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)更換引物后重復(fù)測(cè)序、單體型分析,、基因組實(shí)時(shí)定量PCR和單核苷酸多態(tài)性分析的方法，證明了點(diǎn)突變伴重疊區(qū)域外顯子大片段缺失,、單親二體,、生殖細(xì)胞嵌合或新發(fā)變異是上述"特殊"純合變異的遺傳病理機(jī)制，進(jìn)而為臨床醫(yī)生關(guān)于此類(lèi)疾病有效的個(gè)性化管理,、遺傳咨詢(xún)提供了科學(xué)依據(jù),，同時(shí)亦強(qiáng)調(diào)了基于親代DNA變異的分離分析至關(guān)重要；二代測(cè)序提供的遺傳結(jié)果必須謹(jǐn)慎解釋?zhuān)匾獣r(shí)應(yīng)由生物信息學(xué)分析人員重新審查原始數(shù)據(jù),。對(duì)COL4A5基因已報(bào)道,，且在多個(gè)人群數(shù)據(jù)庫(kù)（包括dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、千人數(shù)據(jù)庫(kù)和ESP6500基因組數(shù)據(jù)庫(kù)）中頻率極低的變異c.2858G>T（p.G953V）基于中國(guó)人重新評(píng)估致病性的研究顯示^[16],，該變異不是導(dǎo)致X連鎖Alport綜合征致病性變異,，在中國(guó)人中的頻率可達(dá)0.0113。研究結(jié)果提示對(duì)已報(bào)道的致病性變異的解讀必須結(jié)合患者的臨床表現(xiàn),，且需注意人群數(shù)據(jù)庫(kù)中某變異在不同種族中發(fā)生頻率不同,。可見(jiàn)研究性實(shí)驗(yàn)室對(duì)于精準(zhǔn)診斷遺傳性腎臟病必不可少,。

綜上所述,，診斷性實(shí)驗(yàn)室在遺傳性腎臟病分子診斷中的作用毋庸置疑，然而精準(zhǔn)診斷此類(lèi)疾病的基礎(chǔ)是臨床醫(yī)生首先要識(shí)別出可能的此類(lèi)疾病患者,，然后依據(jù)患者表型選擇恰當(dāng)?shù)倪z傳檢測(cè)技術(shù)手段和合適的組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),，獲得遺傳檢測(cè)報(bào)告后應(yīng)結(jié)合患者表型、可能的遺傳模式以及共識(shí)指南等進(jìn)行臨床解讀,。此外,，在研究性實(shí)驗(yàn)室中可有機(jī)地結(jié)合患者、應(yīng)疾病需要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,、選擇技術(shù)方法,，對(duì)診斷性實(shí)驗(yàn)室無(wú)法解決的一些特殊問(wèn)題進(jìn)行求證、解決,，從而為每一位患病個(gè)體及所在家庭的精準(zhǔn)診斷,、客觀遺傳咨詢(xún)提供科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊罁?jù)。