免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定和分析,，就實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言,，免疫組化技術(shù)主要涉及抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果的描述與分析、圖片的確定與選取,、相關(guān)數(shù)據(jù)的提供,。

免疫組化結(jié)果的判定原則：

⒈必須同時設(shè)對照染色。沒有對照染色的免疫組化染色結(jié)果是不可信的,。

⒉抗原表達(dá)必須在特定部位,。如LCA應(yīng)定位在細(xì)胞膜上；CK應(yīng)定位在細(xì)胞漿內(nèi),；PCNA及p53蛋白應(yīng)定位在細(xì)胞核內(nèi),；EMA應(yīng)定位在細(xì)胞膜上等等。不在抗原所在部位的陽性著色,，一概不能視為陽性。

⒊陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá),。由于檢測方法靈敏度有高低之分,，有時可因染色方法靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng),，判斷時應(yīng)注意,。

⒋盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的陽性表達(dá),，特別是酶免疫標(biāo)記,。因?yàn)檫@類陽性著色多系內(nèi)源干擾，或系人為因素所致。 ⒌對免疫組化標(biāo)記結(jié)果的意義不能絕對化,，應(yīng)結(jié)合臨床資料,、X線等影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析。

對照染色設(shè)計：

(一）對照染色的目的

設(shè)對照的目的是為了排除假陰性和假陽性,。假陰性的原因主要有三種： ① 組織處理不當(dāng),，抗原丟失過多或被遮蔽；

② 抗體失活,、效價過低或稀釋度不合適（主要指一抗,，即特異性抗體）； ③ 染色步驟遺漏及差錯,，或顯色劑的選擇,、緩沖液pH和離子強(qiáng)度不當(dāng)?shù)取?假陽性均系由多種因素造成的非特異著色所致，原因主要有： ① 自發(fā)熒光或內(nèi)源酶等干擾,； ② 抗體試劑不純(特別是一抗）,；

③ 操作失誤，如污染,、切片干枯或顯色劑操作不當(dāng)?shù)龋?④ Fc受體的干擾,，等等。

（二）對照的種類及其選用目的

對照染色大致可分為四類：即陽性組織對照,、陰性組織和陰性試劑對照及自身對照,。

⒈陽性組織對照 指用已證實(shí)含有靶抗原的同源及不同源組織切片或細(xì)胞涂片與待檢實(shí)驗(yàn)切片同時作同樣處理和免疫染色的組織對照。正確的結(jié)果應(yīng)呈現(xiàn)陽性,，目的是為了證實(shí)所用免疫組化染色流程的有效性,，排除假陰性的可能。

⒉陰性組織對照 指用已證實(shí)不含靶抗原的同步處理和免疫標(biāo)記染色的組織對照,。正確的結(jié)果應(yīng)為陰性,，目的是除外假陽性。

⒊陰性試劑對照 是指用于證實(shí)在免疫組化染色中所用試劑,，尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性而所設(shè)立的同步免疫染色對照,，包括有：空白對照、替代對照,、吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)等,。目的在于除外假陽性和證實(shí)所用免疫組化試劑及其技術(shù)方法的有效性和待檢實(shí)驗(yàn)切片免疫標(biāo)記陽性結(jié)果的可靠性。

⑴ 空白對照指以緩沖液（PBS,、TBS等）取代第一抗體（主要的,，必要時還可做第二抗體及橋聯(lián)抗體的空白取代），其他各步不變的試劑對照染色,，結(jié)果應(yīng)為陰性,。

⑵ 取代對照 指以所用方法第一抗體同源動物的正常血清,，或與本實(shí)驗(yàn)無關(guān)的抗體(靶生物缺如的)取代第一抗體，其他步驟不變的試劑對照染色,，結(jié)果應(yīng)為陰性,。

⑶ 吸收試驗(yàn) 是指用事先經(jīng)過量抗原吸收的第一抗體上清液取代第一抗體，其他步驟不變的免疫染色試劑對照,。結(jié)果應(yīng)是陰性或陽性著色明顯減弱（吸收不全時）,。

⑷ 抑制試驗(yàn) 是指用標(biāo)記抗體和未標(biāo)記抗體（可以是一抗，也可以是二抗或橋抗體）兩者的混合物作試劑,，其他步驟不變的免疫組化染色試劑對照,，結(jié)果其陽性著色應(yīng)成比例的減弱（等量或1：9）。此試劑對照多用于直接法,。

這類陰性試劑對照的選用原則是：

①空白對照不能省,，其他對照在預(yù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)多做，尤其是應(yīng)用新抗體試劑,；

② 對照必需與實(shí)驗(yàn)片同步進(jìn)行染色,；

③ 對照的結(jié)果應(yīng)附合要求。

⒋自身對照 是指在同一標(biāo)記切片上的自身組織成分的陰性背景對照,。即與靶抗原陽性反應(yīng)細(xì)胞或成分相鄰的陰性背景結(jié)構(gòu)的顯色,，結(jié)果應(yīng)為陰性或著色較淺，需與陽性著色成分呈鮮明對比,。目的在于排除內(nèi)源性干擾產(chǎn)生的假陽性和因抗原彌散移位造成的錯誤結(jié)果,。

非特異性染色：

非特異染色是指免疫組化染色過程中產(chǎn)生的非靶抗原的呈色結(jié)果，屬假陽性,，又稱背景著色,，能嚴(yán)重干擾免疫組化染色結(jié)果的正確判斷，應(yīng)竭力避免或減輕,。其原因涉及免疫組化染色流程的各個環(huán)節(jié),，可來自：

① 內(nèi)源性干擾(自發(fā)熒光、內(nèi)源酶,、內(nèi)源性生物素等),；

② 試劑污染(質(zhì)量差，交叉反應(yīng),，F(xiàn)c受體干擾等),；

③ 組織處理不當(dāng)(組織固定不及時或固定不良所導(dǎo)致的抗原彌散移位、洗滌不充分所導(dǎo)致的游離試劑殘留等),。

糾正的方法視原因而異,，可在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,，采用有針對性的糾正對策,，即對癥下藥,。

陽性標(biāo)記的形態(tài)特征和判斷：

免疫組化標(biāo)記具有一定形態(tài)特點(diǎn)，若能熟練掌握則有助于對免疫組化標(biāo)記結(jié)果的正確判斷,。特點(diǎn)包括定性,、定位和定量三方面。

免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo),，實(shí)際工作中常采用強(qiáng)度和密度結(jié)合的方法綜合計量,，與抗原含量有關(guān)；陽性細(xì)胞的著色形態(tài)及組織分布特點(diǎn)主要是定位指標(biāo),，與功能有關(guān),。

一、陽性標(biāo)記免疫特征

分”弱(+),、中(++),、強(qiáng)(+++)”三級。免疫熒光法（FITC為例）則表現(xiàn)為淺綠色熒光,、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光,；

免疫酶標(biāo)記（HRP- DAB/H2O2）則表現(xiàn)為淡黃色細(xì)顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒,，后者耀眼易見,。一般圖片照像，原則上多取強(qiáng)陽性區(qū)域,。

二,、陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例）

可分為①胞膜型；②胞核型,；③胞質(zhì)(漿)型,；④微絨毛型和⑤復(fù)合型（胞膜-胞質(zhì)兼有，胞核-胞質(zhì)兼有,，或微絨毛-胞質(zhì)兼有）等五種陽性細(xì)胞類型,。這與抗原所在部位相關(guān)聯(lián)，但應(yīng)注意排除因組織固定不好引起的抗原彌散假象,，尤其是復(fù)合型圖像,。

三、陽性標(biāo)記組織學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例）

免疫組化染色陽性細(xì)胞在組織中的分布排列形式可以有如下7種：①局灶型,；②彌漫型,；③片塊型；④網(wǎng)狀型,；⑤腺管型,；⑥腔緣型和⑦菊團(tuán)型等。這主要取決抗原抗體復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的分布和陽性細(xì)胞在組織內(nèi)的群體分布特點(diǎn),。

四,、陽性標(biāo)記強(qiáng)度特征

依照細(xì)胞陽性著色程度（抗原含量）,，可分為：

弱陽性（+）┅1分；

中等陽性（++）┅2分,；

強(qiáng)陽性（+++）┅3分,。

依照陽性細(xì)胞數(shù)量，可分為：

弱陽性（+ ,，指陽性細(xì)胞總數(shù)在25%以下）,；

中等陽性（++,指陽性細(xì)胞總數(shù)在25%—49%)；

強(qiáng)陽性（+++ ,，指陽性細(xì)胞總數(shù)在50%以上),。

目前多采用積分綜合計量。計算公式為：（+）%x1 +（++）%x2+（+++）%x3,；總數(shù)值<1.0者為（+）,，1.0-1.5者為(++),>1.5者為(+++)。至少隨機(jī)觀察5-10個HPF,。