在前面的《淺談流式細(xì)胞儀的工作原理和應(yīng)用》一文發(fā)布以后,，小編發(fā)現(xiàn)有好學(xué)的熱心盆友留言要求出一期單細(xì)胞測序的文章，那么我們今天就給大家介紹點與單細(xì)胞測序相關(guān)的知識,。

單細(xì)胞測序一直是科學(xué)家關(guān)注的一個熱點,，主要涉及單細(xì)胞基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序兩個方面，分別針對單細(xì)胞DNA及RNA進(jìn)行序列分析和比較,。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序(Single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)是在單個細(xì)胞水平對mRNA進(jìn)行高通量測序的一項新技術(shù),，原理是將分離的單個細(xì)胞中微量的mRNA通過擴(kuò)增后再進(jìn)行高通量測序。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序能夠有效解決組織樣本細(xì)胞異質(zhì)性以及常規(guī)RNA-seq被掩蓋的細(xì)胞群內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性難題,，有助于發(fā)現(xiàn)新的稀有細(xì)胞類型,，并深入了解細(xì)胞生長過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

單細(xì)胞基因組測序目前主要有兩種擴(kuò)增方法：MALBAC方法及MDA方法,，而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組目前主要有三種方法：SMART擴(kuò)增技術(shù)、10×genomics技術(shù)及Andeplete技術(shù),。今天主要和大家比較下單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的三種常用方法,。

一、SMART擴(kuò)增技術(shù)：

SMART技術(shù)的出現(xiàn)是一個新的里程碑,。這個稱作Switching Mechanism At 5’ end of the RNA Tran(SMART),，原理實際上非常簡單：在合成cDNA的反應(yīng)中事先加入的3’末端帶Oligo（dG）的SMART引物，由于逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA,，在到達(dá)mRNA的5’末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)”,，即甲基化的G時會連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個（dC），SMART引物的Oligo（dG）與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板,，逆轉(zhuǎn)錄酶會自動轉(zhuǎn)換模板,，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列,，另一端有已知的SMART引物序列,，合成第二鏈后可以利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。由于有5’帽子結(jié)構(gòu)的mRNA才能利用這個反應(yīng)得到能擴(kuò)增的cDNA,，因此擴(kuò)增得到的cDNA就是全長cDNA,。

這個專利的方法是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端轉(zhuǎn)移酶活性，只要單管,，一步即可完成,，不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀,，或者額外的酶反應(yīng)，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量,、高產(chǎn)量的cDNA庫,，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應(yīng)用于直接擴(kuò)增基因,、構(gòu)建cDNA文庫,、已知序列釣全長cDNA（RACE），和用于芯片檢測的cDNA探針的擴(kuò)增等,。

通過SMART技術(shù)得到的主要是mRNA信息,，LncRNA信息大部分會丟失，SMART技術(shù)對于RNA的質(zhì)量要求較高,，如果RNA出現(xiàn)降解會導(dǎo)致mRNA 5’端信息丟失,。通用引物技術(shù)能保證擴(kuò)增的均一性，但PCR引入的突變不能夠分析出來,。

二,、10×genomics技術(shù)：

作為單細(xì)胞測序的另一個重要里程碑，10x genomic公司于2016年2月推出10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution,，此平臺整合了儀器,、試劑盒和信息學(xué)軟件，能全面對接illumina測序儀,，因此可實現(xiàn)大量大細(xì)胞的快速高效標(biāo)記,、測序和分析，獲得單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜和差異情況,，并通過對復(fù)雜細(xì)胞群體進(jìn)行深入細(xì)致分析,，繪制大規(guī)模單細(xì)胞表達(dá)圖譜。

介紹10X Genomics技術(shù)流程前,，首先介紹Gel bead（凝膠磁珠）,。Gel bead由凝膠珠和磁珠上的一段引物構(gòu)成，首先在凝膠微珠上種上特定的DNA片段,，DNA片段由三部分組成：Barcode,、UMI、PolyT組成,。Barcode是16個堿基的長度,。一共有400萬種Barcode，一個微珠是對應(yīng)于一種Barcode,，通過這400萬種Barcode,，可以把凝膠微珠給區(qū)分開。UMI是一段隨機(jī)序列,，也就是說每一個DNA分子,，都有自己的UMI序列,。10個堿基長的UMI，有100萬種序列的變化（4^10 = 1,048,576）,，UMI的作用是為了區(qū)分哪些哪些reads是來自于一個原始cDNA分子,，區(qū)分基因片段重復(fù)還是duplication及區(qū)分是真實的SNP位點還是PCR產(chǎn)生的突變。

Gel bead結(jié)構(gòu) 圖片來源搜狐

通過10×genomics儀器將單個細(xì)胞與單個凝膠微珠通過油相混在一起,，形成油包水的小微滴,，接下來把細(xì)胞膜破掉，讓細(xì)胞當(dāng)中的mRNA游離出來,。游離出來的mRNA與小液滴中的水相混合,，也就是和逆轉(zhuǎn)錄酶、結(jié)合在凝膠微珠上的核酸引物,、以及dNTP底物相接觸,。

接著，發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),。mRNA與凝膠微珠上帶標(biāo)簽的DNA分子相結(jié)合,，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA來,。把這個乳濁液當(dāng)中所有的水相抽出來,，也就是把所有帶了標(biāo)簽的cDNA分子都抽出來，再把這些cDNA分子都加上接頭,，經(jīng)過PCR擴(kuò)增,，做成illumina的測序文庫，放到Illumina的測序儀上進(jìn)行測序,。測序完成之后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,。

10×genomics技術(shù)一次可以同時得到大量大細(xì)胞數(shù)據(jù),，但只能得到mRNA信息，LncRNA大部分信息丟失,，UMI技術(shù)能很好去除認(rèn)為分析引入duplication及PCR引入SNP位點,。同樣對RNA質(zhì)量要求高，降解同樣會引起5’端信息丟失,。

三,、Anydeplete 技術(shù)

Anydeplete技術(shù)首先通過隨機(jī)引物進(jìn)行一鏈合成，一鏈合成引入核苷酸類似物,，用于酶切打斷,，二鏈合成同樣引入核苷酸類似物用于保證鏈特異性。然后兩端加上接頭,，接頭一條鏈也帶有核苷酸類似物,，用于酶切降解,。當(dāng)形成單鏈文庫后，設(shè)計特異性引物與rRNA形成文庫結(jié)合,，一輪退火延伸,，rRNA文庫形成雙鏈結(jié)構(gòu)。Reverse adaptor上帶有特異的酶切位點,，當(dāng)形成雙鏈結(jié)構(gòu)酶切位點被識別,，切去接頭，這樣rRNA形成的文庫不帶有完整的接頭,，而其他文庫帶有完整接頭,，通過PCR擴(kuò)增富積既能得到想要的信息，包含mRNA及LncRNA信息,。同樣Anydeplete技術(shù)與10×genomics技術(shù)一樣,，包含分子標(biāo)簽，可分析duplication及PCR產(chǎn)生突變位點,。

Anydeplete技術(shù)能夠用于降解性樣本,，保證5’端及3’端信息的完整，能同時得到mRNA及LncRNA信息,，如果只希望得到mRNA信息,，Anydeplete技術(shù)則會引起一部分?jǐn)?shù)據(jù)浪費。

應(yīng)用和優(yōu)勢對比：

SMART技術(shù)可用于單細(xì)胞mRNA測序,，對RNA質(zhì)量要求高,，RNA降解會引起5’端信息丟失，沒有分子標(biāo)簽功能,。

10×genomics技術(shù)可用于單細(xì)胞mRNA測序,，對RNA質(zhì)量要求高，RNA降解會引起5’端信息丟失,，有分子標(biāo)簽功能,。

Anydeplete技術(shù)可用于單細(xì)胞mRNA及LncRNA測序，對RNA質(zhì)量要求不高,，可用于降解性樣本測序,，有分子標(biāo)簽功能。

文章來源：每日生物評論

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