前言

基底細(xì)胞樣型乳腺癌(basal-like subtype breast cancer,，BLBC)為高級(jí)別浸潤(rùn)性癌,，ER^-和(或)PR^-,、HER2^-，又稱三陰性乳腺癌(TNBC),。三陰性乳腺癌在多個(gè)層次上均存在異質(zhì)性,，因此不管是診斷還是治療上均面臨著比較大的挑戰(zhàn),。盡管大約30％的TNBC對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療藥物敏感，從而提高生存率,，但目前尚未有獲批的針對(duì)化療耐藥患者的靶向治療藥物,。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）在部分TNBC高表達(dá)，但EGFR靶向療法的臨床受益率只有1.7％-38.7％,，表明針對(duì)EGFR的療法在乳腺癌中具有可變且不可預(yù)測(cè)的反應(yīng),。作者構(gòu)建了一批主要由TNBCs 構(gòu)成的(15/18)的PDX模型，用這些模型來測(cè)試吉非替尼（EGFR抑制劑）的敏感程度,，發(fā)現(xiàn)有1例PDX反應(yīng)比較特殊（GCRC1735,，來自一個(gè)70歲的老年女性），該例樣本對(duì)藥物治療效果非常敏感,。對(duì)來自這位特殊應(yīng)答者的3500個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,，鑒定到顯示出不同生物學(xué)特征的細(xì)胞亞群，其中EGFR高表達(dá)的細(xì)胞在間充質(zhì)/干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群中顯著富集,。分選的EGFR^hi細(xì)胞亞群表現(xiàn)出明顯的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞特征：高ALDH活性,、球形成效率以及成瘤和轉(zhuǎn)移潛能。EGFR^hi細(xì)胞在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中產(chǎn)生EGFR^hi和EGFR^lo細(xì)胞,，表明EGFR依賴性的細(xì)胞擴(kuò)增和分級(jí)狀態(tài)轉(zhuǎn)變,。在獨(dú)立的PDX中鑒定了類似的致瘤性EGFR^hi亞群，其中EGFR表達(dá)與吉非替尼敏感性相關(guān),，這為TNBC患者中EGFR依賴性分級(jí)以及治療干預(yù)提供了新的理解,。

研究思路

文章結(jié)果

1. 乳腺癌患者PDXs對(duì)EGFR抑制的響應(yīng)模型篩選

為了探討臨床上乳腺癌EGFR抑制敏感性的功能機(jī)制，作者構(gòu)建了一個(gè)主要由TNBC構(gòu)成的PDX（patient-derived xenografts）（15/18）模型,，采用PDX臨床試驗(yàn)的方法,，對(duì)EGFR抑制劑吉非替尼的敏感性進(jìn)行隊(duì)列篩選。以前有報(bào)道吉非替尼在TNBC病人里面有效率最高是38.7%,，作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符(6/18,，至少50%腫瘤生長(zhǎng)率抑制)（下圖A）。其中有1例反應(yīng)比較特殊（GCRC1735）,，敏感性最高,，并且在治療7個(gè)月后顯示出明顯的腫瘤抑制，并且沒有出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)反彈（下圖B）,。擴(kuò)大驗(yàn)證獲得相同的結(jié)果（n = 6 gefitinib, n = 7 vehicle）（下圖C,、D），吉非替尼處理兩周后樣本RGFR磷酸化（pEGFR）程度降低&pERK通路下調(diào)（下圖E）,，凋亡通路激活（下圖F,、G）。

對(duì)特異反應(yīng)PDX樣本供體的原發(fā)腫瘤進(jìn)行全面的組織學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組分析,，發(fā)現(xiàn)患者攜帶BRCA1突變（p.C1225Sfs）和TP53突變（p.R249T）（下圖H,、I）。未在EGFR中發(fā)現(xiàn)SNV或拷貝數(shù)改變（CNA）,，EGFR通路相關(guān)的基因也沒有太大的異常（只有TSC2出現(xiàn)亞克隆,，以及FGFR4和MAPK9部分?jǐn)U增），因此EGFR及其信號(hào)通路成員的遺傳改變不能解釋對(duì)EGFR抑制的異常反應(yīng)（下圖J）,，值得探究,。

2. 群體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定間充質(zhì)/干細(xì)胞樣亞群內(nèi)的EGFR表達(dá)差異

常規(guī)方法無法確定吉非替尼對(duì)EGFR抑制的敏感性機(jī)制，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在原發(fā)腫瘤和PDX的惡性細(xì)胞中,，均觀察到EGFR表達(dá)異質(zhì)性（下圖A）,。為了準(zhǔn)確的了解EGFR異質(zhì)表達(dá)的功能相關(guān)性，作者對(duì)小鼠PDX模型的新鮮細(xì)胞利用10X單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（3483個(gè)細(xì)胞,，每個(gè)細(xì)胞平均表達(dá)40564個(gè)轉(zhuǎn)錄本和5146個(gè)基因）,。對(duì)來自前五個(gè)組分的細(xì)胞基于t-SNE聚類分析的方法構(gòu)建出六個(gè)亞群：間充質(zhì)/干細(xì)胞樣亞群、干細(xì)胞樣亞群,、核/線粒體亞群,、增殖細(xì)胞亞群、抗原呈遞亞群,、基質(zhì)細(xì)胞亞群,，另外還鑒定了具有很少基因表達(dá)差異的過渡細(xì)胞亞群，其在t-SNE聚類圖中呈現(xiàn)彌散狀態(tài),，因此將其排除在分析之外（下圖B）,。不同細(xì)胞亞群表達(dá)不同的基因，且EGFR表達(dá)存在差異（下圖C-F）,。

結(jié)合公共乳腺癌數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù),，發(fā)現(xiàn)和其他乳腺癌亞型相比，TNBC中間充質(zhì)/干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群marker基因表達(dá)升高并伴隨不良預(yù)后（下圖G-I）,。此外,，新輔助化療后間充質(zhì)/干細(xì)胞在殘留乳腺腫瘤中富集（下圖J），表明EGFR高表達(dá)細(xì)胞亞群其轉(zhuǎn)錄特征與不良預(yù)后TNBC相關(guān),。

3. EGFR^hi間充質(zhì)/干細(xì)胞亞群具有功能性富集腫瘤的潛力

為了進(jìn)一步研究各個(gè)亞群之間的關(guān)系,，擬時(shí)序（Monocle）分析發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)/干細(xì)胞亞群分布于末端分支,，與位于另一極端的基質(zhì)細(xì)胞亞群&核/線粒體細(xì)胞亞群相對(duì)（下圖A）,。過度細(xì)胞亞群和抗原呈遞細(xì)亞群分布廣泛，增殖細(xì)胞亞群緊鄰著核/線粒體亞群,。間充質(zhì)/干細(xì)胞亞群與正常乳腺干細(xì)胞特征之間存在顯著重疊,，間充質(zhì)/干細(xì)胞Marker基因和EGFR在正常乳房的基質(zhì)細(xì)胞（具有再生特性）中高表達(dá)（下圖B），表明間充質(zhì)/干細(xì)胞亞群的未分化性質(zhì)。

為了鑒定EGFR是否在干細(xì)胞樣/再生性細(xì)胞中高表達(dá),，使用流式分選EGFR^hi和EGFR^lo細(xì)胞亞群,，和單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果一致,，充質(zhì)質(zhì)/干細(xì)胞亞群marker基因在EGFR^hi細(xì)胞高表達(dá)（下圖D）,。為了證明EGFR^hi細(xì)胞是具有更高的成瘤能力，作者分別開展了體內(nèi)和體外驗(yàn)證試驗(yàn),。與EGFR^lo亞群相比,，在EGFR^hi中ALDH活性增強(qiáng)、球形成效率（SFE）提高（下圖E,、F）,，兩者都與腫瘤起始能力相關(guān)。兩種細(xì)胞側(cè)移植后,，EGFR^hi成瘤能力更強(qiáng)（下圖G）,，且EGFR^hi細(xì)胞形成的原發(fā)瘤中，重現(xiàn)了EGFR^hi和EGFR^lo細(xì)胞的異質(zhì)表達(dá)模式（下圖H）,。未分選的細(xì)胞在小鼠體內(nèi)移植成瘤后,，肺部微轉(zhuǎn)移病灶中出現(xiàn)了EGFR^hi和EGFR^lo細(xì)胞的重構(gòu)（下圖I）。為了檢測(cè)這些細(xì)胞亞群是否反映不同的遺傳亞克隆特性,，在由EGFR^hi細(xì)胞建立的不同腫瘤球中研究EGFR的表達(dá),。 發(fā)現(xiàn)EGFR^hi細(xì)胞產(chǎn)生的所有球體表現(xiàn)EGFR表達(dá)異質(zhì)性（下圖J）。這些數(shù)據(jù)支持了腫瘤發(fā)展的分層模型,，其中EGFR^hi細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的致瘤性和轉(zhuǎn)移能力,，并且EGFR^hi細(xì)胞在腫瘤體內(nèi)產(chǎn)生EGFR^lo細(xì)胞。

吉非替尼誘導(dǎo)的腫瘤消退后,，顯微觀察發(fā)現(xiàn)殘存著EGFR陽性,，吉非替尼耐藥細(xì)胞亞群，并且這些細(xì)胞持續(xù)處于非增殖性的EGFR抑制狀態(tài),，但其保持了啟動(dòng)腫瘤發(fā)生的能力,，吉非替尼戒斷后或?qū)⑦@些細(xì)胞再移植給未處理的第二受體小鼠后，腫瘤快速再生長(zhǎng)證明了這一點(diǎn)（下圖K-P）,。

為了理解持久性干細(xì)胞樣群體的存活或增殖擴(kuò)增是否需要EGFR活性,，體外評(píng)估球形成，并在吉非替尼存在下體內(nèi)評(píng)估腫瘤起始,。吉非替尼治療或從培養(yǎng)基中消除EGF并未減少SFE,，表明EGFR激酶活性對(duì)于體外TIC（Tumor-initiating cells）存活不是必需的（下圖Q-S）。盡管在吉非替尼存在下沒有明顯的腫瘤發(fā)生,，但是在治療停止時(shí)出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng),，證明吉非替尼在體內(nèi)不抑制TIC的存活，但是消除了TIC的增殖性生長(zhǎng)（下圖T）。這些數(shù)據(jù)共同支持EGFR^hi TIC形成腫瘤干細(xì)胞的層次結(jié)構(gòu),，其由不依賴于EGFR活性的自我更新的TIC以及高度依賴EGFR活性的EGFR^hi腫瘤擴(kuò)增細(xì)胞組成,。

4.   EGFR^hi異質(zhì)性與TIC活性相關(guān)聯(lián)

使用免疫熒光評(píng)估不同PDX隊(duì)列中EGFR的表達(dá)，觀察到EGFR表達(dá)的不同模式,，在GCRC1735中發(fā)現(xiàn)EGFR表達(dá)異質(zhì)性,，但在其他樣本(GCRC1915)發(fā)現(xiàn)表達(dá)均一性（下圖A-C）。免疫熒光檢測(cè)的EGFR的平均表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤免疫印跡定量顯著相關(guān)（下圖D）,。在PDX組中,，EGFR異質(zhì)性與對(duì)吉非替尼的敏感性增加相關(guān)（下圖E）。

EGFR高表達(dá),、高異質(zhì)性樣本(HCI001)和EGFR高表達(dá),、低異質(zhì)性樣本(GCRC1915) 被選擇來檢查TIC EGFR依賴性。HCI001中觀察到在響應(yīng)吉非替尼時(shí),，腫瘤生長(zhǎng)受抑制,，表現(xiàn)出顯著延長(zhǎng)的無終點(diǎn)存活， GCRC1915中未觀察到對(duì)生長(zhǎng)抑制或終點(diǎn)存活的影響（下圖F,、G）,。EGFR在兩種腫瘤模型中均被磷酸化，并且在治療后48小時(shí)觀察到EGFR抑制,，證明腫瘤樣品中EGFR磷酸化的藥效學(xué)評(píng)估不足以預(yù)測(cè)藥物響應(yīng)（下圖H）,。

為了研究腫瘤起始能力是否依賴于EGFR^hi群體，作者在體內(nèi)評(píng)估了流式分選的EGFR^hi和EGFR^lo亞群成瘤能力,。 EGFR^hi亞群在吉非替尼敏感模型（HCI001）中顯示腫瘤生長(zhǎng)加快,，而在吉非替尼不敏感的腫瘤GCRC1915中，EGFR^hi和EGFR^lo亞群之間的致瘤能力沒有差異（下圖I）,。 值得注意的是,，源自HCI001的EGFR^hi亞群的腫瘤中出現(xiàn)了在未分選的腫瘤中觀察到的EGFR^hi和EGFR^lo表達(dá)的多樣性（下圖J）。

總之,，本文鑒定了人乳腺癌的一個(gè)亞型,，其EGFR表達(dá)異質(zhì)性與TIC活性和腫瘤擴(kuò)展相關(guān)，從而使這些腫瘤對(duì)EGFR抑制敏感,。