作為領(lǐng)先的基因捕獲解決方案提供商，艾吉泰康會(huì)接到形形色色的基因捕獲的定制需求,。其中有一類恰好是當(dāng)下非?；馃岬膯渭?xì)胞相關(guān)的。很多客戶咨詢,，單細(xì)胞擴(kuò)增后的DNA如果拿來做捕獲測序,，需要注意哪些問題呢？今天，小艾將相關(guān)問題匯總整理一下,。

1. DOP-CPR^[1] or PEP^[2]：基于簡并引物或者15nt完全隨機(jī)引物的擴(kuò)增，技術(shù)均發(fā)表于1992年,，目前有成熟的商業(yè)化試劑盒,。

2. MDA^[3]：基于Phi29聚合酶和隨機(jī)六堿基引物的等溫?cái)U(kuò)增，發(fā)表于2002年,。目前仍在使用,。有兩個(gè)方向的技術(shù)改進(jìn)，一個(gè)是將單細(xì)胞的DNA分散至大量的微液滴中（eMDA^[4]和ddMDA^[5]）,，另一個(gè)是使用特殊的引物合成酶（TruePrime^[6]）,。兩個(gè)改進(jìn)均提高了擴(kuò)增的均一性。

3. MALBAC^[7]：謝曉亮老師組2013年發(fā)表,，PCR產(chǎn)物形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),，抑制后續(xù)的PCR擴(kuò)增，可以較好解決擴(kuò)增不均一的問題,。

圖一 三種單細(xì)胞擴(kuò)增方法原理圖示^[8]

4. LIANTI^[9]：謝曉亮老師組2017年發(fā)表，基于Tn5轉(zhuǎn)座酶連接上帶有T7啟動(dòng)子序列的接頭,，并采用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄來擴(kuò)增核酸,。

圖二 LIANTI技術(shù)原理示意圖^[9]

單細(xì)胞全外捕獲的技術(shù)問題

1. 真實(shí)有效深度：人是二倍體生物，單個(gè)細(xì)胞的染色體拷貝只有2個(gè),。因此,，單細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物在測序時(shí)，不論測序深度是多少,，起原始的DNA分子來源都是2個(gè),。如果是生殖細(xì)胞，則只有1個(gè)拷貝,。而普通的測序中,，每1X的深度都代表一個(gè)原始的DNA分子（因?yàn)槿up，多重?cái)U(kuò)增子除外）,。這是單細(xì)胞測序最大的不同之處,。

2. DNA產(chǎn)物總量問題：LIANTI的產(chǎn)物總量較少，謝曉亮老師的論文中提到,，有20ng左右,。片段長度的分布則取決于Tn5轉(zhuǎn)座酶插入時(shí)的間隔。MDA的DNA產(chǎn)出較多,，能達(dá)到μg級(jí)別甚至10μg級(jí)別,，且長度能達(dá)到kb級(jí)別。二代測序有低起始量建庫試劑盒,，這個(gè)DNA的總量是足夠的,；如果是三代建庫,，LIANTI的總量還是不夠，需要增加擴(kuò)增產(chǎn)量,。

3. 覆蓋度問題：這個(gè)是在分析時(shí)會(huì)帶來最大麻煩的地方,。很多檢測需求是真·單細(xì)胞測序，比如胚胎植入前檢測,，擴(kuò)增用的模板來自一個(gè)細(xì)胞的DNA,，那么考慮到細(xì)胞擴(kuò)增前的分選和處理，很難保證DNA沒有斷點(diǎn),。這種斷點(diǎn)的位置,，是無法擴(kuò)增出來的。既然無法擴(kuò)增出來,，也就無法檢測到這個(gè)斷點(diǎn)附近的序列,。比如謝曉亮老師的論文中提到，在25X的平均測序深度下,，不同的方法的全基因組覆蓋度有72%左右的,，也有85%~93%的。我們檢測的客戶樣本也看到了類似的現(xiàn)象,，用全外檢測（平均深度約100X）,，覆蓋度高的可以超過90%，低的也有百分之二三十的,。

4. 均一性問題：單細(xì)胞DNA必須經(jīng)過擴(kuò)增,，而PCR是有不均一性的。事實(shí)上,，根據(jù)LIANTI的論文,，單細(xì)胞擴(kuò)增的均一性很難達(dá)到和bulk cells樣本一致的水平。因此,，在測序結(jié)果中,，過分強(qiáng)調(diào)均一性指標(biāo)（0.2X mean depth coverage或者Fold 80罰分），只會(huì)感覺技術(shù)指標(biāo)過差,。

圖三 不同單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增均一性比較^[9]

5. Duplication問題：一般的全外捕獲測序,，我們認(rèn)為dup主要來自于PCR過程，并不提供樣本的真實(shí)突變信息,。在單細(xì)胞DNA測序時(shí),，由于必須進(jìn)行DNA擴(kuò)增，因此建庫時(shí)的DNA全部都是PCR產(chǎn)物,。分析時(shí)去除dup,，可以消除建庫、捕獲時(shí)的PCR不均一對(duì)堿基分型頻率的影響，但需注意,，在單細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)的不均一是無法通過去dup來消除的,。

好啦，以上是小艾總結(jié)的單細(xì)胞DNA擴(kuò)增產(chǎn)物做捕獲測序時(shí)可能存在的問題,，歡迎大家繼續(xù)提問~

1. Telenius H , Carter N P , Bebb C E , et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.[J]. Genomics, 1992, 13(3):718-725.

2. Zhang L, Cui X, Schmitt K, et al. Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1992, 89(13): 5847-5851.

3. Dean F B, Hosono S, Fang L, et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(8): 5261-5266.

4. Fu Y, Li C, Lu S, et al. Uniform and accurate single-cell sequencing based on emulsion whole-genome amplification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112(38): 11923-11928.

5. Sidore A M, Lan F, Lim S W, et al. Enhanced sequencing coverage with digital droplet multiple displacement amplification[J]. Nucleic acids research, 2016, 44(7): e66-e66.

6. Picher A J, Budeus B, Wafzig O, et al. TruePrime is a novel method for whole-genome amplification from single cells based on Tth PrimPol[J]. Nature communications, 2016, 7(1): 1-16.

7. Zong C, Lu S, Chapman A R, et al. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell[J]. Science, 2012, 338(6114): 1622-1626.

8. Gawad C, Koh W, Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the science[J]. Nature Reviews Genetics, 2016, 17(3): 175.

9. Chen C, Xing D, Tan L, et al. Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI)[J]. Science, 2017, 356(6334): 189-194.

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