作者首先對單細(xì)胞RNA測序 (scRNA-seq) 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腸道干細(xì)胞可進(jìn)一步分成3個亞類：相對靜息狀態(tài)的 ISC-I 和高增殖的 ISC-II,、ISC-III,。分析提示 ISC-I 更傾向干性狀態(tài)而 ISC-II、ISC-III 則偏向于分化狀態(tài),，而且 ISC-I 和 ISC-III 高表達(dá) MHCII 抗原呈遞分子,。作者使用 RNAscope^? 多重?zé)晒鈾z測技術(shù)與免疫熒光技術(shù)在對上述結(jié)果進(jìn)行了驗證。

Fig1. Validation of ISC subsets and their cell cycle status. RNAscope smFISH detection of pan stem cell marker Lgr5, ISC-I marker Cyp2e1 and ISC-III marker Psrc1 all in red and Mki67 in white. Cell borders were assessed with IF for E-cadherin  in green.

ISCs 表達(dá)的 MHCII 是否有意義呢,？作者在體外共培養(yǎng)實驗中,，發(fā)現(xiàn)這些 ISC 可與 CD4⁺ 輔助性T細(xì)胞 (Th) 互作，并遞呈抗原,。通過使用腸道類器官,，作者發(fā)現(xiàn) Th1、Th2 和 Th17 及其細(xì)胞因子 IFNγ,、IL13,、IL17 等促炎信號可促進(jìn) Lgr5⁺ ISC 的分化,，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (T_reg) 及其細(xì)胞因子 IL-10 則促進(jìn) ISC 的自我更新；

接下來作者在體內(nèi)研究了 MHCII 對于 ISCs 的自我更新和分化的影響,。作者通過對 MHCII 條件性基因敲除小鼠 MHCII^△Gut 小鼠和對照小鼠的腸上皮細(xì)胞進(jìn)行 scRNA,，發(fā)現(xiàn)敲除鼠的 ISCs 的比例增加，其中 ISC-II 的比例相對更高一些,。同時還發(fā)現(xiàn)敲除鼠的隱窩固有層中 Th 細(xì)胞減少,。在另一種 MHCII 條件性基因敲除小鼠 MHCII^△ISC 小鼠中也發(fā)現(xiàn)了 LGR5⁺ ISCs 的增多。這些結(jié)果表明,，MHCII 對 ISCs 的自我更新和分化有明顯的作用,。

接下來作者使用沙門氏菌 (Salmonella enterica) 和多形螺旋線蟲 (Heligmosomoides polygyrus) 兩種經(jīng)典模型，分別模擬小腸細(xì)胞對病原菌和寄生蟲的反應(yīng),，并利用 MHCII 條件性基因敲除小鼠 (MHCII^△Gut 小鼠和 MHCII^△ISC 小鼠),，研究不同感染時腸上皮細(xì)胞分化和重塑以及 MHCII 在其中發(fā)揮的作用。發(fā)現(xiàn)野生小鼠感染模型中,，干性基因表達(dá)降低,，而 MHCII 表達(dá)增加，而且 ISC 亞型發(fā)生轉(zhuǎn)變,，ISC-I 降低,、ISC-II 和I SC-III 增加。沙門氏菌會誘導(dǎo) Th1 反應(yīng),，增加 Paneth 細(xì)胞數(shù)量,；而多形螺旋線蟲則會引起 Tuft 細(xì)胞的擴(kuò)增。

在 MHCII 條件性基因敲除小鼠 (MHCII^△Gut 小鼠和 MHCII^△ISC小鼠) 感染后,，發(fā)現(xiàn)多形螺旋線蟲感染的基因敲除小鼠中 Tuft 細(xì)胞幾乎不擴(kuò)增,，而且 LGR5⁺ ISCs 數(shù)量也增加,。這些結(jié)果說明 MHCII 對于病原菌和寄生蟲感染狀態(tài)下的 ISCs 的維持有重要作用,。而在對敲除小鼠的免疫細(xì)胞進(jìn)行 scRNA 分析后，作者還發(fā)現(xiàn)表達(dá)在腸上皮細(xì)胞上的 MHCII 分子對于腸道的免疫系統(tǒng)包括固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)都有重要的影響,，敲除上皮細(xì)胞的 MHCII 會擾亂粘膜免疫反應(yīng),。

最后作者在體內(nèi)利用 Foxp3-DTR 小鼠研究了 T_reg 細(xì)胞對于 LGR5⁺ ISCs 的影響。發(fā)現(xiàn) T_reg 缺失會引起成熟腸上皮細(xì)胞減少,、LGR5⁺ ISCs 減少,、ISC-II 和 ISC-III 的比例增加。

作者根據(jù)以上結(jié)果總結(jié)了 ISCs 與 Th 細(xì)胞的相互作用,。T_reg 和其分泌的細(xì)胞因子 IL-10 能促進(jìn)干細(xì)胞的自我更新,；Th17 和其分泌的 IL-17a 則抑制干細(xì)胞的自我更新、促進(jìn)其分化,。Th1 和 Th2 以及其各自分泌的細(xì)胞因子也會抑制干細(xì)胞的自我更新,，促進(jìn)干細(xì)胞分別向 Paneth 細(xì)胞和 Tuft 細(xì)胞分化,。

在本研究中，研究人員聯(lián)合使用了單細(xì)胞RNA測序 (scRNA-seq),、RNAscope^? 多重?zé)晒鈾z測技術(shù),、類器官培養(yǎng)、細(xì)菌感染模型,、寄生蟲感染模型和其他技術(shù),，揭示了 ISCs 與 Th 細(xì)胞的相互作用以及對于腸上皮細(xì)胞維持的影響。發(fā)現(xiàn)了一類表達(dá) MHCII 的 ISCs 具有向輔助性T細(xì)胞呈遞抗原的能力,。不同類型的 T 細(xì)胞及其細(xì)胞因子則對 ISC 的分化和自我更新起不同作用,，從而影響小鼠對腸道感染的抵抗力。

本文是該課題組繼2017年在《Nature》發(fā)表題為“A single-cell survey of the small intestinal epithelium”^[2] 的文章后又一重要成果,。這些發(fā)現(xiàn)為干細(xì)胞與免疫細(xì)胞間的互作提供了新機(jī)制,。

RNAscope^? ISH 技術(shù)是由 Bio-techne旗下 Advanced Cell Diagnostics (ACD) 公司研發(fā)的 RNA 原位雜交產(chǎn)品，在近年來的生物檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速,。與傳統(tǒng)的 RNA 原位雜交相比,， RNAscope^? ISH 技術(shù)屬于新一代 RNA 原位雜交技術(shù)，其特異性的雙Z探針設(shè)計避免了傳統(tǒng)長鏈 RNA 探針的弊端,，配以自身級聯(lián)放大檢測原理,，可以高效敏感地檢測到目標(biāo) RNA。

該技術(shù)優(yōu)勢如下：

應(yīng)用廣泛: 使用RNAscope^? ISH 技術(shù),，靶點 RNA 為大于等于300個堿基的特異序列,，即可進(jìn)行探針設(shè)計。因而 RNAscope 技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種,，所有組織以及所有基因的檢測,。

特異性：RNAscope 獨特的雙Z (ZZ) 探針設(shè)計有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時降低了背景干擾,。由于結(jié)合在非特異性位點的單個的Z探針不會產(chǎn)生完整的信號放大分子結(jié)合位點,，并會在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大,，使得探針的信號具有高度特異性,。探針設(shè)計合成需要 2~4 周時間即可完成。

靈敏度：RNAscope^? ISH 技術(shù)檢測每個 RNA 分子時,，只需三對雙Z (ZZ) 探針即可完成雜交和信號可視化,。

單分子可視化和單細(xì)胞定量: 使用 RNAscope^? ISH 技術(shù)雜交上三對及以上雙Z探針即可在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細(xì)胞內(nèi)RNA 的表達(dá)水平,。

兼容降解的RNA: 由于僅利用三對雙Z探針即可檢測到目標(biāo)RNA,，而通常針對靶點RNA設(shè)計的探針為20對雙Z探針，因而即使目標(biāo)RNA發(fā)生部分降解,，仍可以穩(wěn)定有效地檢測到靶點RNA,。

檢測結(jié)果穩(wěn)定一致性：由于工業(yè)化合成 RNAscope^? ISH 技術(shù)用到的探針以及所有檢測試劑,，且該技術(shù)針對不同樣本類型 (冰凍切片，石蠟切片,，懸浮細(xì)胞,，貼壁細(xì)胞等) 已經(jīng)有成熟的實驗操作流程，故使得 RNAscope^? ISH 技術(shù)檢測結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性,。除了可以在實驗室進(jìn)行手工操作外,，該產(chǎn)品也可以在 Leica 以及羅氏 Ventana 自動平臺上運行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù),。

多通道多靶點同時檢測：由于 RNAscope^? ISH 技術(shù)可以同時進(jìn)行多通道探針雜交以及信號放大,，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中,，可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA,。

Reference:

1. Biton, M.H., Adam L.; Rogel, Noga; Burgin, Grace; Beyaz, Semir; Schnell, Alexandra; Ashenberg, Orr; Su, Chien-Wen; Smillie, Christopher; Shekhar, Karthik; Chen, Zuojia; Wu, Chuan; Ordovas-Montanes, Jose; Alvarez, David; Herbst, Rebecca H.; Zhang, Mei; Tirosh, Itay; Dionne, Danielle; Nguyen, Lan T.; Xifaras, Michael E.; Shalek, Alex K.; von Andrian, Ulrich H.; Graham, Daniel B.; Rozenblatt-Rosen, Orit; Shi, Hai Ning; Kuchroo, Vijay; Yilmaz, Omer H.; Regev, Aviv; Xavier, Ramnik J., T Helper Cell Cytokines Modulate Intestinal Stem Cell Renewal and Differentiation. Cell, 2018.

2. Haber, A.L.B., M.; Rogel, N.; Herbst, R. H.; Shekhar, K.; Smillie, C.; Burgin, G.; Delorey, T. M.; Howitt, M. R.; Katz, Y.; Tirosh, I.; Beyaz, S.; Dionne, D.; Zhang, M.; Raychowdhury, R.; Garrett, W. S.; Rozenblatt-Rosen, O.; Shi, H. N.; Yilmaz, O.; Xavier, R. J.; Regev, A., A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature, 2017. 551(7680): p. 333-339.