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5.2 有關(guān)文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)路線方面高通量測(cè)序(high-throughput sequencing)并不是指一般意義上通量高的測(cè)序,，而是特指二代測(cè)序(next generation sequencing,，NGS)。NGS也翻譯成下一代測(cè)序,、新一代測(cè)序,、平行測(cè)序。NGS一次反應(yīng)能同時(shí)對(duì)數(shù)百億個(gè)核酸分子進(jìn)行測(cè)序（cluster密度高達(dá)數(shù)M/mm2）,，雖然測(cè)序長(zhǎng)度（讀長(zhǎng)）比一代測(cè)序短,，但是模板分子數(shù)（=平行進(jìn)行的測(cè)序反應(yīng)數(shù)）的增加幅度驚人，所以測(cè)序通量比一代測(cè)序提高了數(shù)千萬(wàn)倍,，測(cè)序成本的降低速度超越摩爾定律,。由于數(shù)據(jù)量大規(guī)模提高，NGS使得對(duì)一個(gè)物種進(jìn)行基因組分析和轉(zhuǎn)錄組分析成為現(xiàn)實(shí),；由于成本大規(guī)模降低,，NGS使得臨床和消費(fèi)者基因檢測(cè)應(yīng)用變成了現(xiàn)實(shí)。【云】一代測(cè)序與二代測(cè)序的要點(diǎn)比較如下：技術(shù) 讀長(zhǎng)(bp) 模板數(shù)量 通量 增加倍數(shù)二代測(cè)序 150-300 100M-20G 100M-6T 60Mde novo測(cè)序也叫從頭測(cè)序,，指一個(gè)物種第一次開(kāi)展全基因組測(cè)序，其NGS數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析由于沒(méi)有現(xiàn)成的基因組參考序列(reference sequence)可用,，算法比較特殊,，難度也比較大。通常會(huì)組合運(yùn)用多種測(cè)序方式,，比如NGS,，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（提供RNA剪接與可變轉(zhuǎn)錄本等信息）,，三代測(cè)序（長(zhǎng)讀長(zhǎng)）等技術(shù)，數(shù)據(jù)相互參照,，以取得高質(zhì)量的組裝圖,，因此成本也比較高。de novo測(cè)序的化學(xué)反應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)NGS測(cè)序一樣,；但是其生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析算法不同,，全基因組序列組裝過(guò)程中不使用基因組參考序列,，運(yùn)算耗時(shí)較長(zhǎng),。隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，基因組測(cè)序所需成本和時(shí)間較傳統(tǒng)技術(shù)大幅降低,，越來(lái)越多的物種獲得了全基因組序列,。有了基因組參考序列后，對(duì)于同一物種其他個(gè)體的測(cè)序,，其生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析就變得相對(duì)簡(jiǎn)單了,，此種測(cè)序稱(chēng)為重測(cè)序。什么是重測(cè)序（re-sequencing）,？重測(cè)序是對(duì)曾經(jīng)進(jìn)行過(guò)WGS測(cè)序,、數(shù)據(jù)庫(kù)中具有reference sequence的物種的不同個(gè)體進(jìn)行測(cè)序。這種測(cè)序的化學(xué)反應(yīng)部分與標(biāo)準(zhǔn)的NGS一樣,，但是生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析比de novo測(cè)序簡(jiǎn)單,，依賴reference sequence進(jìn)行全基因組組裝，運(yùn)算簡(jiǎn)單,，速度快,。重測(cè)序可以應(yīng)用于個(gè)體水平或群體水平的全基因組差異分析，解析與疾病,、家系遺傳,、癌癥發(fā)生、藥效等有關(guān)的基因變異,，研究其致病機(jī)理,，尋找新的藥物作用靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)新藥,，篩選靶向藥適用人群等,。隨著基因組測(cè)序成本的不斷降低，人類(lèi)疾病的致病突變研究由外顯子區(qū)擴(kuò)大到了全基因組范圍,，實(shí)現(xiàn)了在全基因組水平檢測(cè)疾病關(guān)聯(lián)的常見(jiàn),、低頻甚至罕見(jiàn)的變異，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價(jià)值,。什么是全基因組測(cè)序（whole genome sequencing, WGS）,？就是對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行NGS測(cè)序,，測(cè)序區(qū)域包括外顯子、內(nèi)含子以及基因之間區(qū)域,，測(cè)序類(lèi)型包括de novo sequencing和re-sequencing,。WGS文庫(kù)構(gòu)建流程是所有NGS應(yīng)用中最簡(jiǎn)單也是最基本的，其他技術(shù)方法都是在此基礎(chǔ)上衍生發(fā)展出來(lái)的,。什么是外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing, WES）,？只對(duì)某一個(gè)基因組的全部外顯子區(qū)域進(jìn)行NGS測(cè)序，測(cè)序區(qū)域只包括外顯子,，有時(shí)還包括少量UTR區(qū)域,，但是不包括內(nèi)含子、不包括基因之間區(qū)域,。這是因?yàn)橛信R床意義的基因變異主要發(fā)生在外顯子區(qū)域,，而外顯子組只占基因組的2%左右，WES可以比WGS大幅度降低測(cè)序費(fèi)用,。【云】WES文庫(kù)的構(gòu)建流程比WGS幾乎復(fù)雜一倍,。WES測(cè)序首先也要構(gòu)建WGS文庫(kù)，然后利用針對(duì)外顯子區(qū)域的大量長(zhǎng)探針進(jìn)行大規(guī)模雜交,，從WGS文庫(kù)中把外顯子片段捕獲下來(lái),，再通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。Southern雜交的探針長(zhǎng)度21 bp,，而外顯子捕獲的探針可以長(zhǎng)達(dá)120 bp,，這是因?yàn)殚L(zhǎng)探針比短探針具備更好的容錯(cuò)性，可以兼容各種未知的基因變異,，從而在外顯子文庫(kù)中保留更多的基因變異信息,。靶基因區(qū)域比外顯子組更小的靶向測(cè)序稱(chēng)為panel測(cè)序。Panel測(cè)序的基因數(shù)量可變,，根據(jù)研究目的可多可少,，少到1個(gè)基因，多到幾千個(gè)基因,。其中包括所有臨床驗(yàn)證過(guò)的遺傳病致病基因的panel,，稱(chēng)為臨床全外顯子組測(cè)序(clinical exome sequencing, CES)。Panel測(cè)序與外顯子組測(cè)序統(tǒng)稱(chēng)靶向測(cè)序,。靶向測(cè)序都有一個(gè)靶基因捕獲與富集的過(guò)程,。捕獲富集的方法主要有兩種：探針雜交和多重PCR擴(kuò)增。技術(shù) 靶區(qū)域大小 建庫(kù)時(shí)間 數(shù)據(jù)量 測(cè)序深度 成本WES外顯子組 60M,，小50倍 2.5天 10G 150x 低什么是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（transcriptome sequencing,，RNA-seq）？轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）指特定組織部位的細(xì)胞群,、在特定時(shí)間點(diǎn)（即某一功能狀態(tài)下）轉(zhuǎn)錄的全體RNA（包括mRNA和非編碼RNA）的種類(lèi)與拷貝數(shù),。研究人員僅需要一次試驗(yàn),，即可快速生成帶poly-A尾巴的RNA的完整序列信息，分析基因表達(dá),、等位基因特異性表達(dá),、發(fā)現(xiàn)新的剪接異構(gòu)體和罕見(jiàn)轉(zhuǎn)錄等轉(zhuǎn)錄組相關(guān)信息。【云】轉(zhuǎn)錄組的內(nèi)容主要體現(xiàn)在基因表達(dá)圖式上,，所以轉(zhuǎn)錄組與基因表達(dá)基本就是同義詞,。基因組主要體現(xiàn)在基因變異（包括多態(tài)性和突變）上,，所以基因組與基因序列大致就是同義詞,。與基因組相比，轉(zhuǎn)錄組的最大特色是：基因表達(dá)具有時(shí)間特異性和空間特異性,。對(duì)于不同的組織樣本,，轉(zhuǎn)錄組不一樣,；即使是同一組織,，它在不同的發(fā)育階段和/或不同的生理狀態(tài)下，其轉(zhuǎn)錄組也不一樣,。如果要研究RNA,，樣本種類(lèi)多，不能互相取代,?；蚪M就單純多了，基本上全身一樣,、終生不變,。除了腫瘤體細(xì)胞變異具有時(shí)間和空間特異性之外，基本上終生不變,；除了生殖細(xì)胞是單倍體以外,，基本上全身一樣。這是因?yàn)榛蜃园l(fā)發(fā)生變異的頻率很低,；所發(fā)生的變異當(dāng)中,，很大一部分又被機(jī)體自身修復(fù)了。如果研究基因組,，不同類(lèi)型的樣本可用互相取代,。除了癌組織與癌旁組織要嚴(yán)格區(qū)分，不可替代之外,，研究遺傳病的時(shí)候,，外周血、唾液和新鮮冷凍組織等樣本可以任取一種,，其檢測(cè)結(jié)果是基本一樣的,。你沒(méi)有看錯(cuò)，小RNA (small RNA)就是指長(zhǎng)度短,、分子量小的RNA,。小RNA種類(lèi)繁多，比較常見(jiàn)的包括micro RNA (miRNA),、siRNA和piRNA等,，它們調(diào)控基因表達(dá)、新陳代謝,、細(xì)胞生長(zhǎng),、個(gè)體發(fā)育、疾病發(fā)生等生理過(guò)程,。在各種小RNA中,，lncRNA和miRNA是比較有特色的兩種，備受重視,。成熟的miRNA是長(zhǎng)17~24 nt的單鏈非編碼RNA,，它通過(guò)與mRNA相互作用，影響目標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性及翻譯,，最終誘導(dǎo)基因沉默或者被降解,。lncRNA（long noncoding RNA，長(zhǎng)鏈非編碼RNA）雖然號(hào)稱(chēng)長(zhǎng)鏈,，也屬于小RNA,，因?yàn)樗皇窍鄬?duì)于其他小RNA來(lái)說(shuō)才比較長(zhǎng)，與mRNA相比一點(diǎn)也不長(zhǎng),。小RNA測(cè)序指對(duì)特定細(xì)胞,、組織、或者體液樣本中的全部small RNA進(jìn)行深度測(cè)序并進(jìn)行定量分析,。由于小RNA長(zhǎng)度短,，只需要進(jìn)行1x50 bp的單端(single read)測(cè)序就足夠了，可以節(jié)省成本,。small RNA測(cè)序有兩種策略,。一是先將長(zhǎng)度在18-30 nt范圍的small RNA從總RNA中分離出來(lái)，體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA,，然后在其兩端加上通用接頭,，PCR擴(kuò)增后測(cè)序。一是不分離small RNA,，先加5’-接頭,，再加3’-接頭，利用特別的酶的特性，只在天然帶有3’-OH的小RNA的末端加接頭,，而人工打斷的mRNA碎片不接,，從而把小RNA與mRNA區(qū)分開(kāi)。lncRNA測(cè)序也有兩種策略,。一是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,，然后在數(shù)據(jù)分析過(guò)程中通過(guò)生物信息學(xué)的手段過(guò)濾去除mRNA數(shù)據(jù)，剩下的就是lncRNA數(shù)據(jù),。一是先用ribo-zero試劑去除樣本中的rRNA,，然后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。由于rRNA占RNA樣本的90%多,，去除rRNA可以節(jié)省測(cè)序成本,。對(duì)small RNA進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，可以獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜,，實(shí)現(xiàn)未知miRNA分子的挖掘,、小RNA作用靶基因的預(yù)測(cè)與鑒定、樣品間miRNA表達(dá)差異分析,、miRNA聚類(lèi)和表達(dá)譜分析等目標(biāo),。基于NGS的miRNA測(cè)序,，一次實(shí)驗(yàn)即可獲得數(shù)百萬(wàn)條miRNA序列,，能夠快速鑒定不同組織、不同發(fā)育階段,、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的miRNA的種類(lèi)及其表達(dá)差異，為研究miRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力的工具,。什么是宏基因組（metagenome）測(cè)序,？宏基因組學(xué)(metagenomics)又稱(chēng)元基因組學(xué)、環(huán)境基因組學(xué),、生態(tài)基因組學(xué),，研究樣本中的整個(gè)微生物群落，以直接從環(huán)境樣本中提取的基因組遺傳物質(zhì)（即混合DNA）為樣本,，而無(wú)需進(jìn)行細(xì)菌或其他微生物的分離,、培養(yǎng)。相對(duì)于傳統(tǒng)的單個(gè)細(xì)菌研究來(lái)說(shuō),，它具有眾多優(yōu)勢(shì),，其中最主要的有兩點(diǎn)：(1) 微生物通常以群落方式共生于某一小生境中，它們的很多特性是基于整個(gè)群落環(huán)境及個(gè)體間的相互影響的,，因此研究metagenomics比單個(gè)個(gè)體更能發(fā)現(xiàn)其特性,；(2) Metagenomics研究無(wú)需分離單個(gè)細(xì)菌，可以研究那些不能被實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的微生物,。【云】宏基因組測(cè)序神似鳥(niǎo)槍法,。鳥(niǎo)槍法不用分離,、克隆靶基因，宏基因組測(cè)序不用分離,、培養(yǎng)目標(biāo)微生物,。二者都能提高工作效率。與單一樣本檢測(cè)相比,，混合樣本的檢測(cè)要求技術(shù)方法,、試劑盒的靈敏度更高。NGS可用做宏基因組測(cè)序,，一代測(cè)序和PCR就不行,，正如NGS可以做NIPT，一代測(cè)序和PCR就不行一樣,。混合樣本檢測(cè)可用提高效率,，節(jié)省成本，那是以先進(jìn)技術(shù)為代價(jià)的,。沒(méi)有金剛鉆,，混樣需慎重！
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