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雖然已經(jīng)解析出來的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)日益增多(可以到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB中查詢其結(jié)構(gòu)是否被解析)，但是很多小伙伴們的研究目標(biāo)的結(jié)構(gòu)還沒有被解析（實(shí)際上是大部分蛋白結(jié)構(gòu)都沒有被解析）,。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB：http://www./ 那么,，在實(shí)驗(yàn)之外，有其他方法獲得生物大分子的結(jié)構(gòu)嗎,？當(dāng)然有啊,，那就是結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)啊。 PS：結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)獲得的結(jié)構(gòu)不一定準(zhǔn)確,，不過近年來隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)大以及算法的改進(jìn),，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性越來越高。 關(guān)于核酸RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),，之前我們公眾號(hào)介紹過RNAstructure的使用：《如何繪制高大上的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)圖,？》（關(guān)于RNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，我們稍后會(huì)有推文,。）我們先來介紹一下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),。 一、背景介紹 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)從低維度到高維度劃分為四級(jí)： 一級(jí)結(jié)構(gòu)——氨基酸序列,； 二級(jí)結(jié)構(gòu)——主鏈原子形成的局部空間構(gòu)象,，如α螺旋，β折疊,； 三級(jí)結(jié)構(gòu)——二級(jí)結(jié)構(gòu)在三維空間排列形成三維結(jié)構(gòu),； 四級(jí)結(jié)構(gòu)——不同亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物大分子。 在二級(jí)結(jié)構(gòu)和三節(jié)結(jié)構(gòu)之間,，還存在超二級(jí)結(jié)構(gòu)（有些書籍稱作motif,，模體/基序）以及結(jié)構(gòu)域,。 二、工具使用 從一級(jí)序列我們能夠獲得哪些信息呢,？小師弟在此給大家安利一個(gè)網(wǎng)站,，https://web./protparam/。 它的主界面非常簡(jiǎn)單,，我們可以輸入蛋白質(zhì)的AC號(hào)或者蛋白質(zhì)序列,，然后點(diǎn)擊compute parameters, 然后就可以獲得這個(gè)蛋白質(zhì)的諸多信息了。 PS：ExPASy 是一個(gè)神器的網(wǎng)站,，大家可以通過網(wǎng)址https://www./resources來訪問其提供的各種生物信息學(xué)工具,，有很多妙用哦！之前我們?cè)?a style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(2, 30, 170); word-wrap: break-word !important; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; -webkit-tap-highlight-color: rgba(0, 0, 0, 0);" target="_blank">研究Protein,，這些技術(shù)不得不看中有提到其中的PROSITE的用法,。 在跳轉(zhuǎn)出來的結(jié)果頁(yè),，我們可以獲得如下一些信息：
三、結(jié)果解讀和研究意義 分子質(zhì)量在SDS-PAGE電泳以及western blot中非常有用,。但是,，在SDS-PAGE或者western blot實(shí)驗(yàn)中,，分子條帶大小并一定和此處給的完全相符，排除了未充分煮樣等實(shí)驗(yàn)操作失誤外,，還可能是因?yàn)檫@些蛋白帶電荷過于特殊,，有別于正常蛋白。對(duì)于蛋白分子質(zhì)量，我們還可以使用氨基酸殘基數(shù)目*110來快速估算,。 等電點(diǎn)就是電解質(zhì)在此pH下,，其所帶的正電荷和負(fù)電荷一樣多，導(dǎo)致其凈電荷為0,。理論等電點(diǎn)在等電聚焦以及使用離子交換層析分離純化蛋白時(shí)非常有用,。使用離子交換層析分離純化兩個(gè)蛋白，一般需要兩個(gè)蛋白等電點(diǎn)相差至少0.5,。對(duì)于常見的蛋白純化親和標(biāo)簽，一般都已經(jīng)通過基因工程改造,，將其等電點(diǎn)改造成明顯偏離普通蛋白的等電點(diǎn)。如His-sumo標(biāo)簽的等電點(diǎn)為5.4,，GST標(biāo)簽的等電點(diǎn)為5.6,，MBP標(biāo)簽的等電點(diǎn)為4.9。而大多數(shù)蛋白的等電點(diǎn)為偏酸性,，略低于7,，因此可以方便的使用離子交換層析方法分離親和標(biāo)簽和不含標(biāo)簽的目的蛋白。 在氨基酸組成方面，我們可以方便的看到20種氨基酸占比（有幾個(gè)氨基酸在大多數(shù)蛋白中的占比相對(duì)恒定,，此是諸多蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)）,。有細(xì)心的小伙伴可能發(fā)現(xiàn),，在20種氨基酸下面,，還有3個(gè)氨基酸符號(hào)，那是什么東東,？說實(shí)話,，第一次打開這個(gè)結(jié)果頁(yè),，我也被這三個(gè)符號(hào)唬住了。本著科研狗+理工男的嚴(yán)謹(jǐn)精神（對(duì),，我大生物就是理科,，那些常常懟生物像文科的，別逼逼,，我不接受反駁,，小師弟要傲嬌一回），我立馬查詢一番,，原來,，B就是Asx，Aspartic acidor Asparagine（天冬氨酸或者天冬酰胺）,；Z就是Glx,，Glutamine or Glutamic acid（谷氨酰胺或者谷氨酸）；X就是Xaa,，Any amino acid（任意氨基酸）,。也就是說，這3個(gè)符號(hào)是用來表示暫時(shí)還有歧義的氨基酸殘基的,，并不是什么稀有氨基酸,。 下面還有荷電氨基酸統(tǒng)計(jì)。分別統(tǒng)計(jì)了帶負(fù)電氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）的數(shù)量,，以及帶正電氨基酸（賴氨酸和精氨酸）的數(shù)量,。有小伙伴可能會(huì)好奇，堿性氨基酸不是賴氨酸,、精氨酸,、組氨酸3個(gè)嗎？這里面為什么沒有組氨酸呢,？因?yàn)榻M氨酸是一種弱堿性氨基酸,，在生理狀態(tài)下基本上不帶電的,。不信，我給你看個(gè)表格,。 我們可以看到,，組氨酸的等電點(diǎn)為7.59，而人體血液的pH在7.35-7.45,，其他多種體液也都是偏弱堿性（當(dāng)然,，胃液這種變態(tài)不算的，它的pH變態(tài)的為0.9-1.5）,，所以說組氨酸在生理狀態(tài)下基本上不帶電,，所以就不參與統(tǒng)計(jì)嘍！
酸堿體質(zhì)理論 消光系數(shù)和吸收度：根據(jù)朗伯比爾定律A=lg(1/T)=Kbc （A為吸光度,，T為透射比,，是出射光強(qiáng)度（I）比入射光強(qiáng)度(I0)，c為吸光物質(zhì)的濃度,，單位為mol/L,，b為吸收層厚度，單位為厘米）,，吸光度和溶液中的溶質(zhì)濃度以及光程長(zhǎng)度成正比,，這個(gè)比例系數(shù)K就是我們的消光系數(shù)。那么消光系數(shù)有什么用呢,？我們可以通過分光光度計(jì)測(cè)量出吸光度值A(chǔ)bs（測(cè)量入射光和出射光的比值,，并取對(duì)數(shù)）,，然后除以（光程*消光系數(shù)）,，就可以知道蛋白質(zhì)的濃度了。
簡(jiǎn)單的來說,，我們?nèi)? ul蛋白溶液,，使用nanodrop測(cè)量出吸光度值A(chǔ),，然后直接除以這里給的吸收度,，就可以得到蛋白質(zhì)濃度了（nanodrop默認(rèn)的設(shè)置是1 Abs=1mg/ml）。 整個(gè)過程不超過2分鐘,，比起B(yǎng)radford，Lowry之流測(cè)蛋白濃度,，不知道要快多少倍,。 實(shí)際上,，這個(gè)消光系數(shù)和吸收度我們自己都可以計(jì)算出來的,，計(jì)算方法也很簡(jiǎn)單： 消光系數(shù)=Numb(Trp)*5500 + Numb(Tyr)*1490+Numb(Cystine)*125 吸收度=消光系數(shù)/分子質(zhì)量 Numb表示個(gè)數(shù) 從上述公式,，我們也可以知道,，一個(gè)蛋白質(zhì)分子的消光系數(shù)主要取決于色氨酸（要不怎么叫做“色”氨酸呢,？）、酪氨酸以及胱氨酸的含量,。如果一個(gè)序列中含有多個(gè)半胱氨酸,，考慮到兩個(gè)半胱氨酸可以被氧化生成一個(gè)胱氨酸，因此,，有多個(gè)半胱氨酸的序列，ExPASy都給了兩個(gè)消光系數(shù),，一個(gè)是所有半胱氨酸都用于生成胱氨酸,，一個(gè)是所有半胱氨酸都是還原形式,，沒有生成任何胱氨酸。小伙伴們可以用計(jì)算器根據(jù)前面氨基酸組成的圖,，按照這里的公式計(jì)算一下消光系數(shù)和吸收度，看是否一致哦,！ 我為什么詳細(xì)介紹消光系數(shù)的計(jì)算呢,？因?yàn)楹芏嘈』锇樵诘鞍讓?shí)驗(yàn)中會(huì)做突變分析，現(xiàn)在我們知道了,，如果沒有消除或者新增色氨酸,、酪氨酸以及半胱氨酸,，一個(gè)蛋白的消光系數(shù)是不會(huì)發(fā)生變化的（吸收度會(huì)變化一點(diǎn)點(diǎn),，因?yàn)榉肿淤|(zhì)量會(huì)有一點(diǎn)點(diǎn)變化，不過基本上不用考慮）,，那么我們就不用重新計(jì)算消光系數(shù)了。
半衰期：半衰期用來衡量目的蛋白在體內(nèi)的穩(wěn)定性,。蛋白質(zhì)在細(xì)胞中處于動(dòng)態(tài)平衡,，在其合成之后,，它的壽命基本上就已經(jīng)決定了。也就是說,，細(xì)胞這個(gè)家伙為了保證自己的運(yùn)轉(zhuǎn)正常，給大多數(shù)蛋白都設(shè)定了一個(gè)使用期限,，防止超期限執(zhí)行任務(wù)的蛋白因?yàn)槔匣鲥e(cuò),，而衰老的蛋白會(huì)被回收利用或者消除（小師弟感受到了強(qiáng)烈的宿命論！?。,。?/p> 而決定這個(gè)使用期限（用半衰期表示）的,，就是蛋白質(zhì)自身N端的前幾個(gè)氨基酸序列,。因此，這個(gè)ExPASy程序會(huì)把我們輸入序列的前幾個(gè)氨基酸當(dāng)做N端序列計(jì)算這個(gè)蛋白質(zhì)的半衰期,，并且給出了在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞,、酵母和大腸桿菌這3種模式細(xì)胞中的半衰期。
文章中經(jīng)常通過蛋白半衰期來研究泛素化-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的蛋白降解 不穩(wěn)定系數(shù)：不穩(wěn)定系數(shù)用來衡量目的蛋白在體外的穩(wěn)定性,。不穩(wěn)定系數(shù)基于之前研究者的發(fā)現(xiàn),，也即某些二肽在穩(wěn)定蛋白和不穩(wěn)定蛋白中的出現(xiàn)概論相差很大，因此,，可以通過這些二肽的出現(xiàn)頻率來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)在體外的穩(wěn)定性,。不穩(wěn)定系數(shù)越小，表明此蛋白越穩(wěn)定。在判別標(biāo)準(zhǔn)上,，將不穩(wěn)定系數(shù)小于40的蛋白判定為能夠穩(wěn)定存在,。結(jié)合小師弟多年純化蛋白的經(jīng)驗(yàn)（苦逼經(jīng)歷），這項(xiàng)預(yù)測(cè)還是相對(duì)比較準(zhǔn)確的,。對(duì)于被預(yù)測(cè)為不穩(wěn)定的蛋白,，尤其是那些數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于40的目的蛋白，小伙伴如果對(duì)其進(jìn)行操作,，一定要加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哦,，因?yàn)檫@些蛋白在4℃放個(gè)兩三天，就可能降解了哦,！ 脂肪系數(shù)：脂肪系數(shù)也可以用來衡量目的蛋白的穩(wěn)定性,。我們知道，蛋白質(zhì)折疊的一個(gè)主要驅(qū)動(dòng)力就是疏水相互作用,。而脂肪系數(shù)用丙氨酸,、纈氨酸、亮氨酸,、異亮氨酸這4個(gè)疏水氨基酸的出現(xiàn)頻次*相關(guān)權(quán)重并加和,，得到了一個(gè)脂肪系數(shù)。脂肪系數(shù)越高,，蛋白相對(duì)越穩(wěn)定,。 總平均親水性：用于衡量目的蛋白的總體平均親水性。通過將親水氨基酸賦正值,，將疏水氨基酸賦負(fù)值,，加和后除以氨基酸數(shù)目，得到總體的平均親疏水性,。數(shù)值越大,，親水性越強(qiáng)。實(shí)際上,，對(duì)于多結(jié)構(gòu)域蛋白此數(shù)值意義不是很大,，因?yàn)榈鞍追肿又屑扔惺杷Y(jié)構(gòu)域，也有親水結(jié)構(gòu)域,，兩者數(shù)值會(huì)相互抵消,。GRAVY主要是結(jié)合局部親疏水性打分，獲得如下圖所示親疏水性打分圖,，可以用來預(yù)測(cè)跨膜區(qū)（跨膜區(qū)相對(duì)于總體序列高度疏水,，峰圖中間橫線就是代表總平均親水性）。
好了,，內(nèi)容就到這里,。第一次寫推文，可能有點(diǎn)過于詳細(xì)和啰嗦，大家多提點(diǎn)意見,，以后小師弟我多多改進(jìn),。 |
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