PI和7-AAD可用來染色死細胞,，標(biāo)準(zhǔn)的細胞表面染色分析中用來排除死細胞,。該染料不能通過完好的細胞膜，但可通過已破壞的細胞膜進入胞內(nèi),。PI進入死細胞后,，嵌入雙鏈DNA或雙鏈RNA中，而7-AAD則優(yōu)先嵌入雙鏈DNA,。因為該嵌合使非共價結(jié)合,，所以重懸細胞用的緩沖液中必須含有該染料，以保證死細胞被染色,。

1. 染色細胞的表面抗原之后,，用流式細胞染色緩沖液（貨號#00-4222）洗滌細胞1-2次。

2. 在適量的流式細胞染色緩沖液中重懸細胞,。

3. 每100μL細胞中加入5μL PI（貨號# 00-6990）或7-AAD（貨號# 00-6993）染色液,。

4. 在冰上或室溫下孵育5-15分鐘。切勿洗滌細胞,。

注：在實驗過程中,，緩沖液內(nèi)必須含有PI或7-AAD。加入PI或7-AAD

后切勿洗滌細胞,。

5. 使用流式細胞儀分析樣本,。

注：應(yīng)在孵育后4小時內(nèi)進行分析，因為細胞長期保留在 PI 或 7-AAD

之中,，會造成細胞死亡,。在2-8°C下避光存放，直到分析,。

鈣黃綠素AM,、鈣黃綠素紫 450AM和鈣黃綠素藍AM可輕易穿透細胞膜，選擇性標(biāo)記活細胞,，適用于流式細胞分析或熒光顯微分析,；而細胞膜破壞的死細胞不能保留鈣黃綠素。如要精準(zhǔn)分辨出死活細胞群,，建議同時使用Annexin V或7-AAD染色,。

1. 準(zhǔn)備單細胞懸液。

2. 在流式細胞染色緩沖液（0.1–1 mL）中重懸細胞,，濃度為1-5x10e6細胞/mL,。

3. 加入建議濃度的鈣黃綠素染料并混勻。（參見產(chǎn)品說明）

注：根據(jù)實驗情況,，可以使用流式細胞染色緩沖液（貨號# 00-4222）或PBS制備稀釋的工作液,。

注：鈣黃綠素AM （貨號#65-0853）/鈣黃綠素紫450 AM（貨號#65-0854）/鈣黃綠素藍AM（貨號#65-0855）

4. 室溫下孵育30分鐘，注意避光,。

5. 加入2mL流式細胞染色緩沖液,，并在室溫、400–600 x g下離心5分鐘,，棄上清,。

6. 重復(fù)第5步。

7. [可選]染色細胞的表面蛋白,。詳細說明參見“流式細胞術(shù)中的蛋白染色”,。

8. 使用流式細胞儀分析樣本。

CyTRAK? Orange（貨號#65-0881）和DRAQ5?（貨號#65-0880）是與雙鏈DNA具有高度親和力的蒽醌染料,?？梢源┩讣毎ぃ虼擞脕順?biāo)記活細胞,、死細胞或固定后細胞中的DNA,。該染料在流式細胞術(shù)中用于區(qū)分有核與無核細胞,。熒光顯微鏡下，它們用于識別細胞核的位置,。

1. 制備單細胞懸液,。

2. [可選]染色細胞的表面蛋白。詳細說明參見“流式細胞術(shù)中的蛋白染色”,。

3. 用細胞培養(yǎng)基或其他緩沖液洗滌細胞,，然后用培養(yǎng)基或其他緩沖液，將細胞重懸為1x10e7細胞/mL,。

注：避免使用含疊氮化鈉的緩沖液,。

4. 向細胞中加入CyTRAK Orange或DRAQ5, 使其終濃度達到2-10μM。并在室溫或37℃下孵育10-30分鐘,。注意避光,。

注：最佳濃度和標(biāo)記條件應(yīng)該進一步優(yōu)化，以獲得最佳檢測性能,。

5. 加入2mL流式細胞染色緩沖液,，室溫下400–600xg離心5分鐘，棄上清,。

6. 在適量的流式細胞染色緩沖液（貨號#00-4222）中重懸細胞,。

7. 使用流式細胞儀分析樣本。

FVD細胞活性染料（FVD）能對細胞膜破壞的細胞進行染色,，通過共價鍵與細胞內(nèi)的蛋白交聯(lián),，不可逆地結(jié)合到所有物種的死細胞內(nèi)。

1. 在12 x 75 mm流式管中準(zhǔn)備細胞,。

2. 在不含疊氮化物和血清/蛋白質(zhì)的PBS中洗滌細胞2次,。

3. 在不含疊氮化物和蛋白質(zhì)的PBS中重懸細胞至1–10x10e6/mL。

注：為了保持細胞染色的一致性,，不建議對體積不足0.5mL的樣本進行染色,。

4. 向每毫升細胞中加入1μL FVD并立即渦旋。

5. 在2-8°C下孵育30分鐘,，避光,。

6. 用流式細胞染色緩沖液（貨號#00-4222）或同類溶液洗滌細胞1-2次。

7. 按需繼續(xù)實驗,。

注：以上操作流程為在不含疊氮化物和蛋白質(zhì)的PBS中染色,，如果實在含有疊氮化物和蛋白質(zhì)的PBS中染色，請聯(lián)系我們（電話：010-57438396）獲取具體操作步驟,。

圖1. 活性染料FVD eFluor? 520檢測結(jié)果

用ConA刺激小鼠脾細胞4天,。上圖：根據(jù)前向和側(cè)向散設(shè)門圈出全部細胞用于分析CD4和CD8指標(biāo)。下圖：根據(jù)FVD eFluor? 520對活細胞設(shè)門,，然后進行CD4和CD8分析,，可以明顯看到排除死細胞干擾后數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確,。

Annexins是與磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合力很高的鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白。PS在正常生理條件下主要位于細胞質(zhì)膜的內(nèi)面,。細胞凋亡開始后,，PS在磷脂雙分子層上的不對稱分布被破壞，轉(zhuǎn)移至細胞膜的外面,，因此形成細胞自我吞噬作用,。PS一旦位于細胞膜的外表面,，就會被熒光標(biāo)記的Annexin V結(jié)合上,。

1. 將1體積10X反應(yīng)緩沖液與9體積蒸餾水混合，制備1X結(jié)合緩沖液,。

2. 收集細胞,。

3. 用1X PBS洗滌細胞一次，然后用1X結(jié)合緩沖液洗滌一次,。

4. 用1X結(jié)合緩沖液重懸細胞至1-5x 10e6細胞/mL,。

5. 向100uL單細胞懸液中加入5μL熒光染料結(jié)合的Annexin V（貨號# 88-8103/88-8007/88-8006/ 88-8005/88-8102/88-8008）。

6. 室溫下孵育10-15分鐘,，注意避光,。

7. 加入2mL 1X結(jié)合緩沖液，并在室溫400–600xg下離心5分鐘,，棄上清,。

8. 在200μL 1X結(jié)合緩沖液中重懸細胞。

9. 加入5μL PI或7-AAD活性染料,，然后在冰上或室溫下孵育5-15分鐘,。

注: 在數(shù)據(jù)采集過程中，緩沖液內(nèi)必須存在碘化丙啶或7-AAD,。加入PI或7-AAD后切勿洗滌細胞,。

10. 使用流式細胞儀分析樣本。

注: 細胞應(yīng)該在孵育后4小時內(nèi)進行分析,，因為細胞長期保留在PI或7-AAD之中,，會對細胞存活度造成影響。在2-8°C下避光存放,，直到用于分析,。

圖2. Annexin V PE細胞凋亡檢測結(jié)果

將小鼠胸腺細胞制成單細胞懸液，并在37°C下過夜孵育,，然后檢測凋亡細胞群,。收集細胞并用Annexin V PE細胞凋亡檢測試劑盒染色 （貨號#88-8102）。

圖3. Annexin V凋亡細胞檢測結(jié)果

Annexin V+ PI-的細胞群中含有凋亡早期的細胞,，未經(jīng)過處理（左圖）或經(jīng)過10?M喜樹堿處理4小時（右圖）的Jurkat細胞使用Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒染色,。