(一)      什么是雙熒光素酶,？

答：雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素,。其中熒火蟲熒光素是從甲蟲（Photinus pyralis）中分離得到，分子量為61kDa,；而海腎（Renilla）熒光素酶則是從海腎（Renilla reniformis）中分離，分子量為36kDa,。這兩種酶的區(qū)別之一是他們的底物和輔因子不同：螢火蟲熒光素酶需要熒光素,、氧氣、ATP和鎂離子同時存在才能發(fā)光,；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素（coelenterazine）和氧氣,。螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的區(qū)別之二是發(fā)光的顏色不同：螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色，波長550-570nm,；而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍光,，波長480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同,，所以在雙報告實驗中得到廣泛應(yīng)用,，它們的發(fā)光原理如下所示：

(二)      為什么要采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)？

答：單報告基因?qū)嶒炌鶗艿礁鞣N實驗條件的影響,，而雙報告基因則通過共轉(zhuǎn)染的“對照”作為內(nèi)參為試驗提供一基準線,，從而可以在最大程度上減小細胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對實驗的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信,。 

(三)      雙熒光素酶在miRNA驗證其靶基因方面的原理是什么,？

答：雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在細胞中同時表達螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒有種源同源性并對應(yīng)不同的反應(yīng)底物,，故而沒有交叉干擾,。得益于超強的光信號和超高的信噪比，本系統(tǒng)被廣泛用于 miRNA 靶基因驗證,。 miRNA 主要通過作用于靶基因的 3’UTR 起作用,，可以將目的基因 3’UTR 區(qū)域構(gòu)建至載體中報告基因 luciferase 的后面，通過比較過表達或者干擾 miRNA 后,，報告基因表達的改變（監(jiān)測螢光素酶的活性變化）可以定量反映 miRNA 對目的基因的抑制作用,，也即用熒光值來判斷miRNA是否和靶基因結(jié)合。

(四)      在利用雙熒光素酶驗證miRNA的靶基因方面,，插入的3’UTR長度應(yīng)該是多少,？

答：靶基因的3’UTR長度不一，將全長都插入載體中不切實際,，通常只插入包括miRNA結(jié)合位點前后200bp左右的序列,，大概就是400bp[1]，但也有文獻插入的是80個bp[2],，有文獻選擇了200多個bp[3],，但嚴格來講,，應(yīng)該選擇400bp，以結(jié)合位點為中心,，上游200bp,，下游200bp。

(五)      常用的雙熒光素酶載體有哪些,？

答：常用的載體有兩種策略,。第一種是兩種熒光素分別位于兩個載體上，第二種是兩種熒光素酶位于同一個載體上,。以第一種為例,，這兩種載體分別為pMIR-REPORT miRNA載體和pRL-TK載體。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn),，pMIR-REPORT miRNA載體是由Ambion開發(fā)的載體,，它用來克隆插入miRNA靶序列，評估細胞內(nèi)miRNA功能的載體,，該載體的圖譜如下所示：

另外的一個載體是pRL-TK載體,，這個載體是由Promega開發(fā)的，pRL-TK是海腎熒光素酶報告載體,，含有SV40增強子,，質(zhì)粒圖譜如下所示：

從這兩個圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，pMIR-REPORT miRNA這個載體主要是用于評估m(xù)iRNA與靶基因3’UTR的結(jié)合,，靶基因的3’UTR放在熒光素酶的后面,，這個熒光素酶是熒火蟲熒光素酶，而pRL-TK這個載體則表達海腎熒光素酶,，將這兩個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進入293細胞中來檢測熒光時,，pRL-TK這個質(zhì)粒起到一個內(nèi)參的作用。

第二種方案就是將熒火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶構(gòu)建到一個載體上,，這樣偏差更小,，畢竟轉(zhuǎn)染一個質(zhì)粒比轉(zhuǎn)染兩個質(zhì)粒要容易，在這方面,，根據(jù)檢索到的資料顯示,，現(xiàn)在的這類質(zhì)主要有Promega公司的pmirGLO質(zhì)粒，圖譜如下所示：

另外的質(zhì)粒就是國產(chǎn)的,，即復(fù)能基因的pEZX-MT06質(zhì)粒,，圖譜如下所示：

(六)      在檢測miRNA靶基因時，需要設(shè)置多少個分組,？

答：首先要知道,，插入的靶基因原始3’UTR的質(zhì)粒叫野生型質(zhì)粒，除此之外，還需要在螢火蟲熒光素酶3’UTR插入miRNA結(jié)合位點突變的序列載體,，這個質(zhì)粒通常叫突變型質(zhì)粒,，最后還有各種對照載體，包括螢火蟲熒光素酶空載體,，miRNA空載體,，還有海腎素?zé)晒廨d體，以文獻中的案例 [4]說明,，此文獻使用了6組來進行驗證,，其分組以及分組說明如下所示：

注：pGL3是熒光素酶報告質(zhì)粒，綠色的是對照組,，即不加miRNA質(zhì)粒，紅色的是正常組,，加miRNA質(zhì)粒,。思路即為熒光素酶質(zhì)粒（3種情況：①空質(zhì)粒；②加了WT靶基因3’UTR的質(zhì)粒,；③加了MUT的靶基因3’UTR的質(zhì)粒）×miRNA precursor（兩種情況,，即加與不加），經(jīng)排列組合,，即為6組,，詳細說明如下所示：

理想結(jié)果：第四組降低，即miRNA能夠與靶基因的3UTR結(jié)合,，第六組不變,，即突變后靶基因3‘UTR不與miRNA結(jié)合。

(七)      在檢測熒光方面,，所使用的儀器是哪些,？

答：最經(jīng)典的儀器就是Promega的GloMax 20/20 發(fā)光檢測儀。但也可以用全波長酶標儀來檢測（本實驗室的儀器是VARIOSKAN LUX）,。螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色,，波長550-570nm；而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍光,，波長480nm,。

(八)      測得結(jié)果的數(shù)據(jù)如何處理？

答：測得的結(jié)果一個螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光信號,，記為RL1,，，海腎熒光素酶產(chǎn)生的信號,，記為RL2,。RL1/RL2將數(shù)據(jù)均一化后，每兩組之間用ANOVA檢測即可,。

(九)      參考資料

1.     Nicolas, F.E., Experimental Validation of MicroRNA Targets Using a Luciferase Reporter System, in MicroRNAs in Development: Methods and Protocols, T. Dalmay, Editor. 2011, Humana Press: Totowa, NJ. p. 139-152.

2.     Zhu, J., et al., TNF-alpha mRNA is negatively regulated by microRNA-181a-5p in maturation of dendritic cells induced by high mobility group box-1 protein. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12239.

3.     Zhu, S., et al., MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem, 2007. 282(19): p. 14328-36.

4.     Shimono, Y., et al., Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells. Cell, 2009. 138(3): p. 592-603.