基因測(cè)序

高通量測(cè)序行業(yè)是基因測(cè)序行業(yè)的領(lǐng)導(dǎo)者。在這辭舊迎新之際,，就讓我們一起來(lái)看看高通量測(cè)序行業(yè)發(fā)展,。

歲末將走，新年即至,，回顧2017年基因測(cè)序行業(yè),，政策大好，資本加持,，測(cè)序大佬上市,，行業(yè)熱點(diǎn)不斷，這其中,，測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展在其中起強(qiáng)大的推動(dòng)作用,。

當(dāng)我們?cè)谡劀y(cè)序行業(yè)發(fā)展時(shí)，不得不談測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷的三次變革,，第一代Sanger測(cè)序技術(shù),，以Sanger雙脫氧終止法的測(cè)序原理進(jìn)行測(cè)序，1986年,，推出測(cè)序儀實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化,，其中最具里程碑的事件是人類(lèi)基因組計(jì)劃HGP，當(dāng)年全球科學(xué)家耗時(shí)近十年完成了人類(lèi)基因組草圖,，然而Sanger測(cè)序通量低,，成本高,，耗時(shí)長(zhǎng)，像HGP這樣奢侈的案例是沒(méi)法復(fù)制到其他物種基因組學(xué)的大規(guī)模測(cè)序項(xiàng)目中,。

距離第一代測(cè)序技術(shù)的20年后,，測(cè)序技術(shù)發(fā)生了一次重大變革，自2005年開(kāi)始,，以羅氏的454,、Illumina 的 Solexa、LifeTechnologies的Solid為開(kāi)端的第二代高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)始登上舞臺(tái),。第二代高通量測(cè)序以邊合成邊測(cè)序?yàn)樵?，通過(guò)對(duì)PCR分子簇上堿基連接的熒光信號(hào)進(jìn)行捕獲，并轉(zhuǎn)換為堿基信息,，與Sanger測(cè)序相比,，具有通量高，單堿基成本低的優(yōu)勢(shì),，并立刻被研究者所應(yīng)用,，發(fā)展到今天，早期三國(guó)鼎立的輝煌時(shí)代已不在,，454和Solid都已出局,，獨(dú)留Illumina“一人霸唱天下”。

然而,，第二代高通量測(cè)序技術(shù)讀長(zhǎng)短的缺陷,，在科研和醫(yī)學(xué)的基因組項(xiàng)目研究中弊端日益凸顯，如何兼顧高通量和讀長(zhǎng)長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì),？這似乎為新一代測(cè)序儀提供了市場(chǎng)入口,。

第三代單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)似乎瞄準(zhǔn)了市場(chǎng)入口，2008年,，Heliscope Bioscience公司推出了世界第一款單分子測(cè)序平臺(tái),，很不幸，已于2012年申請(qǐng)破產(chǎn),，逐漸走出人們的視野。2011年P(guān)acBio公司推出了PacBio RS單分子實(shí)時(shí)測(cè)序儀,，通過(guò)納米技術(shù),、現(xiàn)代光學(xué)系統(tǒng)對(duì)單分子合成中的堿基磷酸基團(tuán)上的熒光信號(hào)進(jìn)行識(shí)別，并轉(zhuǎn)換為堿基信息,，產(chǎn)出的平均讀長(zhǎng)在kb級(jí)別,，相比Illumina的bp級(jí)別的讀長(zhǎng)，優(yōu)勢(shì)明顯,。緊隨其后,，2011年，Oxford Nanopore Technology公司（簡(jiǎn)稱(chēng)ONT）推出了單分子實(shí)時(shí)測(cè)序儀MinION和GridION，Nanopore測(cè)序原理是通過(guò)將單分子堿基穿過(guò)納米孔蛋白的電流變化信號(hào)捕獲,，轉(zhuǎn)換為堿基信息,，相對(duì)PacBio測(cè)序，讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)更加明顯,，可謂“江山代有人才出,一代更比一代強(qiáng)”,。

測(cè)序技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，已有30余年,，因一,、二、三代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用市場(chǎng)的差別,、測(cè)序成本高地不一,，各平臺(tái)上下游發(fā)展之別，目前各測(cè)序技術(shù)都在不同應(yīng)用方向差異化競(jìng)爭(zhēng),，呈現(xiàn)三國(guó)鼎立之勢(shì),，不出意外，預(yù)計(jì)這種現(xiàn)象會(huì)在短期內(nèi)繼續(xù)存在,。

Illumina測(cè)序:穩(wěn)坐測(cè)序頭把交椅

自2006 年,，Illumina 收購(gòu) Solexa 后，就開(kāi)始在測(cè)序領(lǐng)域突飛猛進(jìn),，PK掉了早期的其他第二代高通量測(cè)序平臺(tái)后,，在科研服務(wù)和臨床市場(chǎng)快速發(fā)展，涵蓋靶向技術(shù),、外顯子和全基因組測(cè)序,、基因突變、基因表達(dá),、表觀遺傳學(xué),、宏基因組學(xué)等應(yīng)用方向，現(xiàn)如今測(cè)序市場(chǎng)占有率已達(dá)70%,，已然是測(cè)序行業(yè)巨頭地位,。

除此，Illumina在測(cè)序平臺(tái)系列的持續(xù)升級(jí)中,，不斷將測(cè)序成本降低,，從Hiseq2000到目前還在廣泛應(yīng)用的Hiseq X，已經(jīng)將人類(lèi)全基因組測(cè)序成本從10,000美金降至1000美金,，到今年發(fā)布的Novoseq,，測(cè)序成本將有望降到100美金，NovaSeq 測(cè)序平臺(tái)單次運(yùn)行最多可檢測(cè)48個(gè)人類(lèi)基因組,，運(yùn)行時(shí)可間縮至40個(gè)小時(shí),，這是當(dāng)初HGP舉全球之力的時(shí)代所不能想象的,。

測(cè)序成本的降低，也帶來(lái)下游服務(wù)應(yīng)用市場(chǎng)的開(kāi)拓,，除了目前臨床診斷中成熟應(yīng)用的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷NIPT檢測(cè),，Illumina測(cè)序技術(shù)在腫瘤基因檢測(cè)也異常火熱,，如腫瘤液體活檢,，可用于早期癌癥篩查，腫瘤患者在靶向藥物治療中進(jìn)行病情耐藥跟蹤,，連Illumina公司自己都看好這個(gè)市場(chǎng),，成立了子公司Grail，專(zhuān)門(mén)進(jìn)行癌癥早期篩查,。Illumina測(cè)序技術(shù)在消費(fèi)級(jí)基因檢測(cè)服務(wù)中也潛力無(wú)限,，如美國(guó)的23andMe，是獲得FDA 批準(zhǔn)的,、“直接面向消費(fèi)者”的基因檢測(cè)服務(wù),，估值超 10億美元，如國(guó)內(nèi)的wegene,，23魔方,，360基因等，不過(guò)發(fā)展之路并不如23andMe樂(lè)觀,，在未來(lái)政策和市場(chǎng)管制完善的情況下,，消費(fèi)級(jí)基因檢測(cè)的市場(chǎng)需求會(huì)在一定時(shí)間節(jié)點(diǎn)得到釋放。

在中國(guó),，大量投資機(jī)構(gòu)看好基于第二代高通量測(cè)序的下游終端服務(wù)市場(chǎng),，不論是無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷NIPT，胚胎植入前遺傳學(xué)篩查/診斷PGD/PGS還是腫瘤基因檢測(cè),，亦或者是遺傳病基因檢測(cè),，一說(shuō)起市場(chǎng)估值，不是幾十億就是百億元的級(jí)別,。雖然目前基于Illumina測(cè)序技術(shù)的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷NIPT檢測(cè)的應(yīng)用已在國(guó)內(nèi)商業(yè)化,，但腫瘤診斷、胚胎植入前遺傳學(xué)篩查和診斷,、遺傳病診斷因技術(shù)局限,、政策和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等因素，目前并未形成成熟的市場(chǎng),，需要時(shí)間積累，未來(lái)的路任重而道遠(yuǎn),。

PacBio測(cè)序技術(shù):發(fā)展之路,，穩(wěn)中有進(jìn)

事實(shí)上,，PacBio測(cè)序技術(shù)的商業(yè)化平臺(tái)在2012年就已推出了，但其最致命的地方是其高達(dá)15%錯(cuò)誤率,，這直接給研究者留下了第一個(gè)不可磨滅的壞印象,，由于當(dāng)時(shí)一個(gè)芯片產(chǎn)量也比較低，使得PacBio公司并未能在當(dāng)時(shí)的高通量測(cè)序領(lǐng)域及時(shí)分得一杯羹,。

技術(shù)的完善需要時(shí)間的打磨,，到2015年，PacBio在試劑升級(jí)和分析軟件上都有了突破,，這時(shí)PacBio RSII平臺(tái)開(kāi)始在基因組學(xué)科研領(lǐng)域發(fā)力,，不斷有論文發(fā)表于Nature，Science等頂級(jí)雜志上,，就人類(lèi)基因組研究論文,，從基因組完善到組裝算法開(kāi)發(fā)，前后發(fā)表論文將近10多篇,，這個(gè)時(shí)候,，科研人員開(kāi)始重新審視PacBio單分子實(shí)時(shí)測(cè)序的技術(shù)，知道了高達(dá)15%的錯(cuò)誤率只是原始錯(cuò)誤,，通過(guò)一定測(cè)序深度,，數(shù)據(jù)可自我糾錯(cuò)，與此同時(shí),，國(guó)內(nèi)提供PacBio測(cè)序的服務(wù)商也抓住時(shí)機(jī)大力推廣,，培育和開(kāi)發(fā)應(yīng)用市場(chǎng)。

2015年10月,，PacBio公司趁熱打鐵,，在美國(guó)人類(lèi)遺傳學(xué)協(xié)會(huì)年會(huì)ASHG上發(fā)布了體型更小通量更高的PacBio Sequel測(cè)序平臺(tái)，這引起科研人員和測(cè)序服務(wù)公司廣泛關(guān)注,，到2016年年初,，國(guó)內(nèi)提供PacBio測(cè)序的服務(wù)公司，都陸續(xù)與PacBio公司開(kāi)始簽約訂購(gòu),，國(guó)內(nèi)科研應(yīng)用市場(chǎng)需求不斷發(fā)力,，到了2017年，測(cè)序服務(wù)商借助資本力量在PacBio三代測(cè)序市場(chǎng)的大動(dòng)作不斷,，紛紛加入到PacBio三代測(cè)序市場(chǎng)的角逐中：2016年年初,，武漢未來(lái)組簽約引進(jìn)6臺(tái)PacBio Sequel，繼續(xù)領(lǐng)跑PacBio測(cè)序服務(wù)市場(chǎng),；2017年年初,，南京揚(yáng)子國(guó)資投資集團(tuán)投資購(gòu)買(mǎi)10臺(tái)Sequel，并委托南京諾禾致源生物科技有限公司運(yùn)行,，在運(yùn)營(yíng)的過(guò)程中,，諾禾致源發(fā)現(xiàn)到PacBio測(cè)序需求的爆發(fā)式增長(zhǎng)后,，2017年8月，又購(gòu)置了10臺(tái)Sequel,，目前諾禾致源已成為全球PacBio Sequel測(cè)序系統(tǒng)的最大用戶(hù),，為布局中國(guó)精準(zhǔn)醫(yī)療市場(chǎng)加碼；2017年7月,，安諾優(yōu)達(dá)在融資7億人民幣后,，開(kāi)始重新布局其基因測(cè)序戰(zhàn)略，于2017年12月,，宣布引進(jìn)10臺(tái)Sequel,，意將打造基因大數(shù)據(jù)云平臺(tái)。

當(dāng)前除了創(chuàng)產(chǎn)前診斷NIPT檢測(cè)已成熟應(yīng)用于臨床市場(chǎng),，其他腫瘤診斷,，生殖醫(yī)療診斷及遺傳病診斷商業(yè)化應(yīng)用仍未成熟，原因很多,，其中一部分原因在于測(cè)序技術(shù)的局限性,，即便Illumina的測(cè)序價(jià)格逐年在降低，即便已應(yīng)用了近十年,，但其短讀長(zhǎng)無(wú)法檢測(cè)或準(zhǔn)確組裝出基因組中重復(fù)序列,，也就無(wú)法應(yīng)用到基因組結(jié)構(gòu)變異（Structural Variation）、拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation）等復(fù)雜變異引起的疾病研究中,，進(jìn)而限制了Illumina測(cè)序技術(shù)在科研和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的其他有前景的領(lǐng)域中應(yīng)用,。

2017年，在Genetics in Medicine期刊上報(bào)道了世界上第一例,，利用第三代PacBio測(cè)序分析找到長(zhǎng)為2,184bp的致病結(jié)構(gòu)變異的臨床案例,，而之前該致病結(jié)構(gòu)變異通過(guò)第二代高通量測(cè)序一直未檢出。同時(shí)已經(jīng)有研究人員應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)獲取特異性序列片段來(lái)開(kāi)發(fā)靶向測(cè)序panel,。似乎PacBio測(cè)序技術(shù)的長(zhǎng)讀長(zhǎng)在醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域迎來(lái)了春天,，在基因組結(jié)構(gòu)變異，全長(zhǎng)mRNA可變剪接體檢測(cè),，表觀甲基化直接檢測(cè)等應(yīng)用領(lǐng)域,，給了PacBio測(cè)序廣闊的發(fā)揮空間，但考慮到當(dāng)前第三代測(cè)序的成本和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確率,，談PacBio測(cè)序的臨床應(yīng)用似乎為時(shí)過(guò)早,。

Nanopore測(cè)序:下一個(gè)測(cè)序市場(chǎng)爆發(fā)點(diǎn)？

相對(duì)目前商業(yè)化應(yīng)用的Illumina或PacBio測(cè)序平臺(tái),，Nanopore測(cè)序技術(shù)的原理從提出到走上市場(chǎng)耗時(shí)最長(zhǎng),，2012年ONT在基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會(huì)（AGBT）會(huì)議上推出了掌上MinION測(cè)序儀，當(dāng)時(shí)轟動(dòng)一時(shí)，但直至2014年ONT才正式開(kāi)始推出MinION試用計(jì)劃,，但數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性及通量等問(wèn)題,，當(dāng)時(shí)還是受到詬病,；直至2016年年底，在試劑芯片的不斷升級(jí)后,，芯片的通量,、讀長(zhǎng)和準(zhǔn)確率都有大幅提升，所應(yīng)用的研究范圍更加廣泛,，不過(guò)直到2017年,，ONT才正式進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，在中國(guó)上海設(shè)立辦公室,，并派駐技術(shù)支持專(zhuān)員為中國(guó)使用者提供技術(shù)服務(wù),。

整體來(lái)說(shuō)，這兩年,，Nanopore測(cè)序技術(shù)的熱點(diǎn)不斷,。2016年5月，ONT發(fā)布了一款比掌上MinION還小的測(cè)序儀SmidgION,，可直接連接到智能手機(jī)上,，檢測(cè)DNA、RNA,；2016年12月ONT的MinION平臺(tái)首次完成了人類(lèi)基因組測(cè)序,；同月，ONT再獲1.26億美元融資,；2017年3月份,，ONT發(fā)布了GridION X5，它含有5個(gè)流動(dòng)槽,，可同時(shí)上機(jī)5個(gè)芯片,，提高單次運(yùn)行產(chǎn)量，可應(yīng)用到大規(guī)模的測(cè)序項(xiàng)目,； 2017年7月,，ONT上榜了2017年全球50大最聰明公司，其中全球醫(yī)療領(lǐng)域最聰明的公司僅14家,；2017年下半年,，ONT正式進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，帶動(dòng)了這個(gè)全球最大測(cè)序服務(wù)市場(chǎng)的熱情和躁動(dòng),。

目前中國(guó)市場(chǎng)中已購(gòu)買(mǎi)ONT平臺(tái)GridION X5測(cè)序儀的公司：藥明明碼引入Nanopore測(cè)序技術(shù),，欲將與基因大數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)結(jié)合應(yīng)用；藥品企業(yè)先聲藥業(yè)旗下的先聲診斷(Simcere Diagnostics) ,，將用Nanopore測(cè)序技術(shù)協(xié)助傳染病控制的臨床診斷,；永諾生物(Forevergen) 旗下ONT測(cè)序獨(dú)立品牌CookGene及武漢未來(lái)組,，將用Nanopore測(cè)序技術(shù)開(kāi)展科研的基因組de novo項(xiàng)目服務(wù)。相比以往那些動(dòng)輒上百萬(wàn)上千萬(wàn)一套的測(cè)序儀而言,，ONT平臺(tái)測(cè)序儀的價(jià)格可謂美好,，尋常實(shí)驗(yàn)室和小型測(cè)序服務(wù)商都配置的起，甚至業(yè)界有戲稱(chēng)說(shuō),，一個(gè)Iphone就能換個(gè)MinION ,，預(yù)計(jì)2018年，ONT平臺(tái)測(cè)序儀會(huì)迎來(lái)一個(gè)預(yù)定小高潮,。

ONT已在中國(guó)市場(chǎng)投放MinION,，GridION X5兩款測(cè)序儀， 從ONT負(fù)責(zé)中國(guó)業(yè)務(wù)的商務(wù)處得知,，明年中國(guó)市場(chǎng)會(huì)迎來(lái)更高通量測(cè)序儀PromethION,，PromethION含有48個(gè)區(qū)別于MinION的Flowcell，差別之處在于PromethION的每個(gè)Flowcell有3,000個(gè)channels,，一次 48小時(shí)的運(yùn)行即可獲得高達(dá)6.2 Tb的數(shù)據(jù),。

在應(yīng)用方向，除了目前科研市場(chǎng)火熱的基因組應(yīng)用,，如取證工作,、水質(zhì)檢測(cè)、面向消費(fèi)者的基因檢測(cè),、生物防御,、細(xì)胞鑒定、疫情爆發(fā)調(diào)查和監(jiān)控,、食品安全等,，ONT與研究者也不斷拓寬醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，如在腫瘤或遺傳病DNA的分析中高分辨率的結(jié)構(gòu)變異分析,；在生殖醫(yī)療中,，可應(yīng)用于胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)或胚胎植入前基因診斷(PGD)，檢測(cè)染色體數(shù)目畸變及增加的潛在風(fēng)險(xiǎn),。

第三代PacBio測(cè)序技術(shù)與第二代Illumina測(cè)序技術(shù)在讀長(zhǎng)和通量上各具特點(diǎn),，在不同應(yīng)用方向和市場(chǎng)上各有優(yōu)劣，因此暫時(shí)尚能和諧共存,，甚至在很多應(yīng)用場(chǎng)景下能有機(jī)的結(jié)合來(lái)提供解決方案,，但是作為具有同樣甚至更高讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的Nanopore測(cè)序技術(shù)，似乎對(duì)PacBio公司來(lái)者不善,，除了搶奪PacBio公司的科研基因組市場(chǎng)外,，ONT似乎也準(zhǔn)備在PacBio意欲發(fā)力的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域分一塊蛋糕。

目前，在中國(guó)我們所能看到的是,，2017年Nanopore測(cè)序技術(shù)似乎迎來(lái)了它的第二個(gè)熱點(diǎn)時(shí)期,，那么它眼前的火熱是初期市場(chǎng)測(cè)序廠家和服務(wù)商的“炒作”？還是下一個(gè)測(cè)序技術(shù)真正的爆發(fā)點(diǎn),？讓時(shí)間證明給我們看,。

如開(kāi)篇所說(shuō)，短期內(nèi)一,、二,、三代測(cè)序技術(shù)將繼續(xù)“百花齊放”，但競(jìng)爭(zhēng)差異化較小的第三代測(cè)序技術(shù)的PacBio和Nanopore測(cè)序技術(shù),，一方面同是第三代新的測(cè)序技術(shù)，需要互相配合培育開(kāi)發(fā)第三代測(cè)序應(yīng)用市場(chǎng),，另外一方面,，在很多應(yīng)用領(lǐng)域，兩者不免會(huì)出現(xiàn)搶奪市場(chǎng)的惡戰(zhàn),。當(dāng)然,，測(cè)序界的老大哥Illumina也不會(huì)坐視不動(dòng)，國(guó)產(chǎn)測(cè)序儀也會(huì)時(shí)刻刷存在感,，看能否擔(dān)得起“國(guó)之重器”名號(hào),，突出重圍，以解國(guó)內(nèi)測(cè)序服務(wù)商受制于上游測(cè)序儀制造商的困境,。

作為生物行業(yè)的一員,，我們并不是沒(méi)有關(guān)系的旁觀者，我們可能是科研或醫(yī)學(xué)測(cè)序服務(wù)的用戶(hù),，也可能是測(cè)序行業(yè)生態(tài)鏈中的從業(yè)者,，還可能是行業(yè)的監(jiān)管部門(mén)，我們既可能在兩者競(jìng)爭(zhēng)中得利,，也可能被傷及,，亦可能需要我們做判斷下決策。所以,，關(guān)注轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng),，持續(xù)獲得生物醫(yī)藥行業(yè)動(dòng)態(tài)。

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