16S rRNA基因是原核生物所特有的基因,，并且在原核生物中具有極高的拷貝數(shù)。全長1 542 nt的DNA序列包含9個間隔的高變區(qū),，兼具特異性和保守性的16S rRNA基因序列作為微生物標記被廣泛應用于研究中,。相比DNA探針、變性梯度凝膠電泳和Sanger測序等方法,，高通量測序技術在16S rRNA基因序列研究中體現(xiàn)出極大的優(yōu)勢,。以Roche，Illumina等為代表的第二代測序技術將16S rRNA基因測序的通量大幅提高,，為研究者提供對特定環(huán)境微生物進行全面分析的可能,。目前，第二代測序技術已經成為環(huán)境微生物研究的主流手段,。但是,，第二代測序技術在16S rRNA基因測序中存在的缺陷也不可忽視——測序片段短。第二代測序平臺中,，測序片段最長的是Roche公司開發(fā)的454 GS FLX+測序儀,，其測序片段長度僅為700 bp。過短的測序片段使得研究人員在微生物16S rRNA基因測序中,，只能選擇部分高變區(qū)進行研究,，這對研究結果的準確性有較大影響。 

目前PacBio 測序儀的測序長度可達到20 000 bp,，這為基于16S rRNA基因測序的微生物研究提供更好的選擇,。本文將為大家總結PacBio的SMRT測序技術在全長16S rRNA的成功應用，最后提出目前存在的問題和可能的解決方案，以期為研究人員采用SMRT測序技術研究微生物16S rRNA基因提供參考,。

利用Pacbio全長16S擴增子測序評估嬰兒配方食品安全性

研究方法

對30個嬰兒奶粉樣品（12份國產,，18份進口）進行PacBio全長16S擴增子測序，測序平臺：PacBio RS Ⅱ,，試劑：P6C4,。

結果分析

1，微生物多樣性及相對豐度分析

“種”水平的微生物多樣性分析及相對豐度（相對豐度>1%）

2,，國產和進口奶粉的優(yōu)勢菌株存在差異

國產配方奶粉以Lactococcuspiscium(27.78%)和Lactococcus lactis(17.16%)為主,。

分析進口嬰兒配方奶粉的優(yōu)勢菌株，

1群以Streptococcus thermophilus(65.55%)為主,，

4群以Lactococcus piscium(27.04%)為主,，

2群和3群以Streptococcus thermophilus、Lactococcus lactis 和 Lactococcus piscium為主,。

3,，預熱處理和桿菌相對含量之間的關系

        通過乳清蛋白氮指數(shù)（whey protein nitrogen index，WPNI)可檢測乳品中乳清蛋白的變性度,，反應乳品的熱處理程度,。本研究將樣品微生物群落“屬”水平上的相對豐度結合WPNI進行分析，結果表明,，預熱處理的溫度與芽孢桿屬（Bacillus sp.）豐度負相關,，與鏈球菌屬（Streptococcus sp.）和乳酸菌屬（Lactobacillus sp.）正相關。

利用Pacbio全長16S擴增子測序于健康奶牛與乳房炎奶牛腸道菌群定量與宏基因組研究

牛場管理,、病原菌感染和奶牛體質等因素都可能造成奶牛乳房炎（體溫升高,，乳房紅腫痛，體細胞數(shù)（SCC）升高,，牛乳呈棕黃色,，膿漿），導致巨額經濟損失,、增加細菌耐藥性,、抗性基因污染，最終威脅食品安全,。因此對益生乳酸菌在奶牛養(yǎng)殖中應用研究具有重要意義

研究方法

選取健康組(CH,，20頭 ，SCC< 30萬/ml),，乳房炎組(cm,，20頭，="" scc="">100萬/mL) ,，采用二代,、三代測序技術相結合的方法從宏基因組角度完成了40頭奶牛糞便中微生物多樣性和Metagenome分析,，探究揭示乳腺炎與奶牛腸道微生物及功能基因的關系。

結果

基于三代測序技術完成健康組,、乳房炎患病組共40頭奶牛腸道微生物組成分析,，共識別出319個細菌種，平均相對含量在0.1%以上的菌種共有28個,。其中蝙蝠弧菌屬Vampirovibrio在乳房炎組含量高,，該菌可引起輕度腹瀉與紅細胞溶血。真桿菌屬Eubacterium,，顫螺旋菌屬Oscillibacter等產酸菌在健康組含量較高,。α多樣性分析結果與Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，健康組微生物物種豐度和多樣性顯著高于乳房炎組,，乳房炎組奶牛腸道微生物結構趨于簡單化,。

利用Pacbio全長16S擴增子測序以評估苜蓿青貯的質量

苜蓿是畜牧業(yè)中重要的飼料作物，它包含很多牲畜生長所需的物質,，如蛋白質,、維生素和礦物質等，目前保存的方法就是青貯法,，在貯藏時一般會加入乳酸菌促進發(fā)酵過程。隨著SMRT技術長讀長優(yōu)勢顯現(xiàn),，研究者通過SMRT測序對四個樣本添加產乳酸菌發(fā)酵前后的微生物菌落進行了研究,。

實驗方法

四種以乳酸菌為基礎的添加劑處理苜蓿青貯；發(fā)酵過程中,，添加劑有利于降低pH值和霉菌毒素,，而增加有機酸；SMRT分析8個發(fā)酵后樣本,，細菌種類和豐度顯著上升,；在原料中，巨大芽孢桿菌是起始優(yōu)勢物種,，經過發(fā)酵后,，添加劑中存在的乳酸片球菌和植物乳桿菌成為優(yōu)勢物種。

研究結果

1,，所有樣本中共鑒定到960種細菌,，其中12種細菌含量均大于1%；

2,，發(fā)酵前后物種數(shù)和相對豐度變化很大,；

3，發(fā)酵后飼料中的微生物組成與所添加的菌群有很大關系,，基于UniFrac的PCoA分析顯示發(fā)酵前和發(fā)酵后的樣本組成差異很大,。

發(fā)酵前后的微生物菌落比較

以上各項成果均提及到一項技術服務-Pacbio測序應用于微生物群落分析，那么，PacBio SMRT測序在微生物群落分析中的優(yōu)勢有哪些,？

PacBio平臺測序產生PhyloTags的過程中不需要擴增,，相較于其他測序平臺降低了測序平臺的特異性偏差；

PacBio平臺測序產生的PhyloTags具有超高的一致準確性,，并且能夠真實反映微生物的高GC/低GC區(qū),，不會產生擴增偏好性。

PacBio公司正在努力改進提高測序正確率,，目前的P6-C4試劑的平均正確率可達86%以上,，讀長可達12Kb。隨著時間的推移,，使用PacBio測序的16s指標將逐漸達到Sanger擴增子的水平,。

關于TBC  

天津生物芯片三代測序平臺自2013年運行至今，作為國內比較早一批提供三代測序服務的機構,，現(xiàn)已形成以PacBio單分子測序RSII和Sequel“雙核”平臺為中心,，現(xiàn)已成功利用三代測序技術完成細菌、真菌,、昆蟲,、動植物、人類等數(shù)百個物種的基因組,、全長轉錄組測序及分析工作,，并開發(fā)建立了基于三代測序技術的靶向測序、宏基因組測序,、表觀遺傳測序,、以及單細胞測序系列方案。 2003年至今,，累計為客戶在國際權威期刊發(fā)表SCI論文178篇,，其中包括：Nature、Nature Communication,、PNAS,、FEMS Microbiol Rev PLoS Genetics。  

歡迎致電022-66229538 或發(fā)郵件[email protected]進行咨詢TBC 16S全長測序服務,！

參考文獻 

1. Y. Zheng, etal., Using PacBio Long-Read High-Throughput Microbial Gene Amplicon SequencingTo Evaluate Infant Formula Safety. J Agric Food Chem (2016)

2,，Weichen , etal.,BaoAssessing quality of Medicago sativa silage by monitoring bacterial composition with single molecule, real-time sequencing technology and various physiological parameters. Scientific Report(2016)