lncRNA芯片分析

1. 歸一化

lncRNA芯片采用的歸一化的方法為quantile normalization,。

2. 差異LncRNA的篩選

lncRNA芯片中既有lncRNA的探針又有mRNA的探針，分別做差異基因的篩選,，篩選方法同表達譜的篩選方法是一致的,，參見表達譜的差異基因篩選。

3. 差異lncRNA的重注釋

lncRNA芯片注釋不完善,，因此需要將篩選出來的lncRNA進行重注釋,。將差異lncRNA在基因組上位置上下游延伸，以尋找lncRNA附近的有功能的基因,。

4. 差異lncRNA靶基因的預測

lncRNA可能通過調(diào)控相應的mRNA發(fā)揮功能,，因此有必要預測lncRNA的靶基因。我們提取差異lncRNA和mRNA的序列,，首先用blast進行初篩，之后用RNAplex進行進一步篩選,，以預測lncRNA可能調(diào)控的mRNA,。

5. 差異lncRNA與靶基因共表達網(wǎng)絡

預測出lncRNA的靶基因后，并可進一步在mRNA的數(shù)據(jù)中探尋該mRNA是否發(fā)生表達量的變化,。由此構建差異lncRNA與靶基因相互作用網(wǎng)絡圖,。

6. 差異lncRNA與差異mRNA的共表達分析

SBC Human lncRNA芯片能同時檢測出差異表達的lncRNA和mRNA。我們將差異lncRNA和差異mRNA在一組樣品中進行共表達分析,，可以發(fā)現(xiàn)與某個lncRNA具有相同表達模式的mRNA,。 要求：每組數(shù)據(jù)3個或3個以上生物學重復

 實驗組：

對照組：

7. 差異lncRNA靶基因的GO analysis

對lncRNA的靶基因進行GO Ontology的生物學的分類,，根據(jù)Fisher's Exact Test,得到p-value，得到lncRNA靶基因?qū)娘@著性功能,，從而了解lncRNA的功能,。

8. 差異lncRNA靶基因的pathway analysis

對lncRNA靶基因按照Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫KEGG和Biocarta來進行分類，對Pathway中的基因進行基于離散分布的顯著性分析,，得到與實驗目的有顯著聯(lián)系的Pathway 分類,由這些pathway對應相應的靶基因,，從而獲得該分類即導致lncRNA差異的最重要Pathway。

9. 差異lncRNA的轉錄因子的預測

提取lncRNA TSS的上游2000bp,，下游500bp,利用HMM的算法根據(jù)TRANSFAC8.1數(shù)據(jù)庫預測其轉錄因子,。

10. lncRNA cis作用機制研究：對于感興趣的差異表達lncRNAs，搜索其上下游100K范圍內(nèi)的所有編碼基因,，并與該lncRNAs 有顯著共表達的基因取交集,。這些在基因組上臨近、且表達模式上共表達的基因很可能被該lncRNAs 所調(diào)控,。

11. lncRNA trans作用機制研究：計算LncRNAs 共表達的編碼基因,，集合與轉錄因子/染色質(zhì)調(diào)控復合物的靶基因集合的交集，利用超幾何分布計算該交集的富集程度,，得到與lncRNAs 顯著相關的轉錄因子,，從而識別可能與lncRNAs 聯(lián)合發(fā)揮調(diào)控作用的轉錄因子/染色質(zhì)調(diào)控因子。

[綜述]長鏈非編碼RNA（lncRNA）

lncRNA

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,，lncRNA）是一類不編碼蛋白的RNA 分子,，長度在200bp 以上，起初被認為是RNA 聚合酶II 轉錄的副產(chǎn)物,，不具有生物學功能,；近期的研究表明lncRNA 具有保守的二級結構，可以與蛋白,、DNA 和RNA 相互作用,，參與多種生物學過程的調(diào)控，尤其在腫瘤當中發(fā)揮了重要的調(diào)控角色,，如染色質(zhì)修飾,、轉錄激活和抑制、轉錄后調(diào)解以及作為miRNA 的誘導分子干擾基因的表達等,。隨著高通量測序技術的發(fā)展,，越來越多的lncRNA 被注釋，但是絕大多數(shù)的lncRNA 的功能仍然不清楚,，因此lncRNA 的研究是一片非常廣闊的未知領域,，具有極大的研究價值和意義。

lncRNA介紹

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,，lncRNA）是一類轉錄本長度超過200nt,、不編碼蛋白的RNA,。lncRNA起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，不具有生物學功能,。然而,，近年來的研究表明lncRNA能在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平上調(diào)控基因表達,，參與了X染色體沉默,、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉錄激活,、轉錄干擾,、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，與人類疾病的發(fā)生,、發(fā)展和防治都有著密切聯(lián)系,。

為何細胞不惜耗費能量對這些非編碼RNA的表達和定位進行嚴格調(diào)控呢？這些RNA分析究竟有何功能,？RNA測序技術的發(fā)展使人們得以初窺這一神秘分子,，現(xiàn)在lncRNA的許多相關信息都可以再新數(shù)據(jù)庫中查到，例如Broad研究所,、哈佛大學和麻省理工共同開發(fā)的Human Body Map lincRNAs catalog,。雖然近年來關于lncRNA的研究進展迅猛，但是現(xiàn)在人們了解到的lncRNA只是冰山一角,，絕大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的,。隨著研究的推進，各類lncRNA的大量發(fā)現(xiàn),，lncRNA的研究作為RNA研究的新領域,，已經(jīng)成為一個非常吸引人的方向，有待廣大科學家去探尋,。

lncRNA研究當前面臨的一個主要挑戰(zhàn)是,，研究工具還在不斷開發(fā)和改進中，而lncRNA研究中非常關鍵的一步就是發(fā)現(xiàn)與特定疾病相關的lncRNA?，F(xiàn)階段,，基因芯片技術發(fā)展趨于成熟穩(wěn)定，在此平臺上,，通過設計不同檢測lncRNA探針篩選lncRNA是一種準確快捷的方法,。

lncRNA特征

lncRNA通常較長，具有mRNA樣結構,，有些具有poly(A)尾巴，有些沒有poly(A)尾巴,，分化過程中有動態(tài)的表達與不同的剪接方式,，與編碼基因相比,，lncRNA表達量更低。

※ 組織特異性：不同組織之間的lncRNA表達量不同,。

※ 時空特異性：同一組織或器官的不同生長階段,，其中的lncRNA表達量也會變化。

※ lncRNA啟動子同樣可以結合轉錄因子,，如Oct3/4,，Nanog，CREB,，Sp1,，c-myc，Sox2與p53,，局部染色質(zhì)組蛋白同樣具有特征性的修飾方式與結構特征,。

※ 大多數(shù)的lncRNA在組織分化發(fā)育過程中，都具有明顯的時空表達特異性,，如有人針對小鼠的1300個lncRNA進行研究,，發(fā)現(xiàn)在腦組織中的不同部位，lncRNA具有不同的表達模式,。

※ 在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達方式,。

※ lncRNA的亞細胞位置上也呈多樣化，在細胞核,、細胞質(zhì)和細胞器均有分布,，甚至某些lncRNA具有獨特的亞細胞位置，有可能是全新的亞細胞構成,。

lncRNA功能

lncRNA可從染色質(zhì)重塑,、轉錄調(diào)控及轉錄后加工等多種層面實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控：

a) lncRNA通過招募染色質(zhì)重塑復合物至特定的基因組位點使其發(fā)生催化活性。如HOTAIR21,，Xist,、RepA和Kcnqot1招募Polycomb complex至HoxD位點，使得X染色體或Kcnq1功能域的組蛋白H3 第27位賴氨酸發(fā)生3甲基化（me3K27）,，誘導異染色質(zhì)形成,，從而抑制該區(qū)域基因表達。

b) lncRNA通過多種機制進行轉錄水平調(diào)控,。lncRNA結合到基因cyclin D1上,，招募RNA結合蛋白TLS來調(diào)控蛋白CBP和p300的組蛋白乙酰轉移酶活性，進而抑制cyclin D1轉錄,。

c) 超保守增強子轉錄出lncRNA-Evf2,，該lncRNA能激活轉錄因子DLX2，進而調(diào)控基因Dlx6轉錄。

d) DHFR次要啟動子區(qū)域轉錄出的lncRNA與該基因主要啟動子區(qū)域結合形成三聚體,，抑制轉錄因子TFIID結合,，從而使基因DHFR發(fā)生沉默。

e) 反義lncRNA能夠與剪接體（splicesome）中鋅指同源mRNA Zeb2的5'剪切位點結合,，使內(nèi)含子未被剪切掉,，而該內(nèi)含子序列中保留有內(nèi)部核糖體進入位點（IRE位點），翻譯過程中識別并結合該位點,，導致Zeb2基因表達和翻譯,。

lncRNA分子機制

隨著lncRNA功能逐步顯現(xiàn)，其與靶點的作用機制成為進一步的熱點,。早期認為原位調(diào)控是LncRNA作用的唯一機制,，它通過招募形成染色質(zhì)修飾復合物而沉默鄰近基因轉錄，例如IGF2R反義RNA(antisense of IGF2RRNA,，AIR),、XIST等。而Hox基因反義基因間RNA(Hox antisense intergenic RNA,，HOTAIR)的發(fā)現(xiàn)提示LncRNA可能存在遠程調(diào)控,。同源異型基因(homeotic genes，HOX)在細胞增殖與定向分化中起關鍵作用,，人類Hox基因簇約含100個ncRNA基因,，其中HOTAIR定位于HOXC基因座12q13.13。HOTAIR的5'端可招募結合多梳蛋白抑制復合物2(polycomb repressive complex2,，PRC2),，借助PRC2上三個H3K27甲基化酶EZH2、SUZ12和EED,，使另一基因座HOXD上長約40kb的序列轉錄沉默,，從而在乳腺上皮細胞內(nèi)使細胞內(nèi)轉錄傾向于胚胎成纖維細胞樣表型。超過20%的LncRNA能夠通過結合PRC2或其他類似復合物發(fā)揮作用,，提示LncRNA的遠程調(diào)控機制在生物體內(nèi)廣泛存在,。

其作用機制如下圖所示，主要包括以下幾種情況：

1) 在編碼蛋白基因的上游啟動子區(qū)（橘色）轉錄,，從而干擾鄰近蛋白編碼基因（藍色）的表達（如酵母SER3基因）,；

2) 抑制RNA 聚合酶Ⅱ，或介導染色質(zhì)重構和組蛋白修飾,，而影響基因（藍色）表達,；

3) lncRNA（紫色）與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈，干擾mRNA的剪切,，進而產(chǎn)生不同的剪切形式,；

4) lncRNA（紫色）與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈,，在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA，調(diào)控基因的表達水平,；

5) lncRNA（綠色）結合在特定蛋白質(zhì)上調(diào)節(jié)相應蛋白的活性,；

6) 作為結構組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復合體；

7) 結合在特定蛋白上從而改變該蛋白的胞質(zhì)定位,；

8) 可作為小分子RNA（如miRNA）的前體分子。