吃,，是個體生存的必要條件。

現(xiàn)在對于調(diào)節(jié)“吃”這一生理過程的研究，可以大致分為兩類,，一類集中在能量代謝穩(wěn)態(tài)（energy homeostasis）的神經(jīng)環(huán)路,，研究饑餓與飽食信號是如何傳遞處理，從腸胃到脊髓,，腦干,，再到大腦更高級中樞的過程。這些研究有許多重要發(fā)現(xiàn),，比如饑餓過程中,，下丘腦弓狀核ARC中的AGRP陽性神經(jīng)元被興奮，同時抑制POMC陽性神經(jīng)元,，促進進食[1],。還有下丘腦室旁核PVN，腦干臂旁核PBN,，延髓孤束核NTS等腦區(qū),，均認為參與控制（regulate）進食的神經(jīng)環(huán)路[2]。

圖1 饑餓過程中弓狀核與下丘腦室旁核調(diào)節(jié)進食的神經(jīng)環(huán)路,。引自[2],。

另外一類研究關(guān)注的是在這個過程中認知與獎賞系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的作用。其中研究比較多的是腹側(cè)被蓋區(qū)VTA作為大腦中多巴胺系統(tǒng)的中心,，還有負責自上而下調(diào)控的前額葉皮層PFC,，負責學(xué)習(xí)與記憶的海馬，都可以參與調(diào)節(jié)（modulate）進食過程[3],。本篇文章關(guān)注的就是中央杏仁核對進食的調(diào)節(jié)作用,。

圖2能量代謝穩(wěn)態(tài)與認知愉悅穩(wěn)態(tài)影響進食過程。引自[3],。

2017年8月21日,，Nature Neuroscience雜志發(fā)表了來自馬克斯-普朗克研究機構(gòu)（Max Planck Institute）Rüdiger Klein實驗室的研究論文《Central amygdala circuits modulate food consumption through a positive-valence mechanism》，通過使用在體細胞水平鈣成像和在體操控腦區(qū)與環(huán)路的方法,，揭示了中央杏仁核（central nucleus of the amygdala, CeA）中表達5-羥色胺2a受體的抑制神經(jīng)元在調(diào)節(jié)食物消耗量中的作用[4],。

圖3 Rüdiger Klein教授，馬普神經(jīng)生物所主任,。

之前,，CeA被認為參與恐懼，焦慮以及調(diào)節(jié)進食行為,。在2014年Caltech的David J. Anderson實驗室發(fā)現(xiàn)了激活PKCδ陽性的CeA抑制性神經(jīng)元可以抑制進食行為,。本文作者通過對大量轉(zhuǎn)基因小鼠庫的篩查，找到了相對特異在CeA表達的Htr2a-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠,，這群小鼠在CeA特異標記表達5-羥色胺2a受體亞型的神經(jīng)元,。

首先,，他們發(fā)現(xiàn)這群Htr2a 的神經(jīng)元和PKCδ 神經(jīng)元幾乎不共標（如圖4）。

圖4 Htr2a 的神經(jīng)元和PKCδ 神經(jīng)元代表兩類獨立的CeA抑制神經(jīng)元,。

接下來,，他們使用了藥理學(xué)操控（DREADDs）的方法研究激活Htr2a 的神經(jīng)元是否對進食有影響。在Htr2a-Cre小鼠的CeA表達Cre依賴的激活性hM3Dq腺相關(guān)病毒（adenovirus-associated virus, AAV）,，在腹腔注射CNO后,，在沒做饑餓處理的情況下，實驗組明顯比對照組吃得多（圖5）,。當然,，小鼠并不是什么因為變傻了，什么都多吃,，作者用和食物外表相似,，硬度也相似的泥塊作為對照，小鼠還是不會多吃的,。

圖5 雙側(cè)激活Htr2a 神經(jīng)元可以使進食增多,。

進一步，作者關(guān)心的是進食的欲望更低的時候,，激活這些Htr2a 神經(jīng)元能否改善進食,。結(jié)果在LiCl處理或者LPS處理導(dǎo)致進食欲望下降的模型中，實驗組小鼠同樣吃得更多,。甚至在一些通常小鼠不愛吃的苦味食物模型中,，實驗組也會增加進食（當然，辨別苦味的能力并沒有改變）,。這些結(jié)果告訴我們,，無論是正常情況還是缺乏進食欲望的情況下，激活Htr2a 神經(jīng)元都可以增加小鼠的進食量,。

是不是這些小鼠為了多吃會更努力的獲取食物呢,？通過訓(xùn)練小鼠通過用鼻字接觸按鈕（鼻觸）從而獲取食物，作者發(fā)現(xiàn)兩組小鼠對獲取食物付出的行為努力并沒有明顯差異,。同樣,，他們也證明了焦慮水平和運動能力并沒有明顯差異。

通過使用另一種激活方法——光遺傳技術(shù),，作者同樣發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果,。20 Hz 473 nm激光直接激活這些神經(jīng)元也能使進食增加。

之后,，作者開始抑制這群Htr2a 神經(jīng)元。首先采用藥理學(xué)的方法,，使用AAV表達了Cre依賴的白喉毒素（diphtheria toxin）進而殺死這些Htr2a 神經(jīng)元,，發(fā)現(xiàn)在正常喂飼料的情況下,，并不影響小鼠每天的進食量與體重。但是在急性剝奪進食24小時后,，小鼠應(yīng)該增加進食的模型中,，殺死Htr2a 神經(jīng)元的小鼠進食量明顯低于對照組（圖6）。

圖6 使用藥理學(xué)方法殺死Htr2a 神經(jīng)元可以減少禁食后進食增加的現(xiàn)象,。

同樣,，他們也使用了光遺傳的方法抑制這群神經(jīng)元，并得到了類似的結(jié)果,。饑餓情況下的實驗組小鼠明顯進食少于對照組,，結(jié)合之前激活的結(jié)果，他們證明了雙向操控這群細胞是可以雙向調(diào)控進食行為的,，即充分又必要（對于證明某一腦區(qū)參與某一功能,，雙向調(diào)控有對應(yīng)的結(jié)果十分重要）。

接下來,，作者把焦點集中在進食過程中,，CeA的Htr2a 神經(jīng)元的鈣信號是如何變化的。

現(xiàn)在研究在體細胞活性變化的方法有單通道或者多通道胞外記錄,，光纖鈣成像記錄,，雙光子鈣成像記錄和神經(jīng)元超微鈣離子成像記錄。胞外記錄的優(yōu)勢在于可以記錄單個細胞的電信號活動,，是最嚴謹最有生理意義的信號,，時間分辨率高（ms），但是技術(shù)難度大,，獲得數(shù)據(jù)的效率低,，并且很難做到細胞特異性記錄（光電極的制作和記錄效率的限制）。剩下的集中記錄的均為鈣信號,，當鈣指示劑熒光上升時,，我們認為反映了細胞或者腦區(qū)的活性上升。光纖成像技術(shù)可以做到細胞特異性記錄,，但是信號反應(yīng)的是腦區(qū)細胞群體鈣信號的變化,，無法精確到單細胞水平。雙光子成像技術(shù)可以做到細胞特異性,，同時精確到細胞水平,，但現(xiàn)階段只能應(yīng)用在皮層，主要受限于雙光子的有效工作距離（數(shù)百微米）,。而神經(jīng)元超微鈣離子成像技術(shù)可以同時具有可應(yīng)用于深部腦區(qū),，細胞特異性，單細胞水平記錄這幾大優(yōu)勢,。所以,，本文作者使用了Inscopix nVista神經(jīng)元超微鈣離子成像技術(shù),。

使用Inscopix nVista神經(jīng)元超微鈣離子成像技術(shù)，他們可以在單細胞水平觀察到CeA的鈣信號變化,。首先,，向Htr2a-Cre小鼠的CeA注射Cre依賴的GCaMP6s病毒并埋植GRIN len（GLP-0673; diameter:0.6 mm, length: ~7.3 mm），兩周之后,，使用配套的微型顯微鏡去觀察在自由運動進食過程中CeA 的Htr2a 神經(jīng)元的鈣信號變化（圖7）,。

圖7 使用Inscopix記錄在體自由運動情況下Htr2a 神經(jīng)元的鈣信號變化。c為采集到的GCaMP熒光信號,，d為經(jīng)過處理的胞體信號,，進而可以做亮度比較分析。

在禁食24小時后,，小鼠在第一次進食行為（first feeding bout）中,，鈣信號在開始時刻明顯的增高，并且在之后繼續(xù)升高（圖8）,。

圖8 在第一次進食行為中,，Htr2a 神經(jīng)元的鈣信號變化。e展示了每只小鼠所有細胞的平均反應(yīng),。f展示了這4只小鼠共計69個細胞的平均反應(yīng),。g為所有69個細胞的群體反應(yīng)。

當把所有進食行為（all feeding bouts）對應(yīng)的鈣信號進行平均,，他們發(fā)現(xiàn)了有22%的Htr2a 神經(jīng)元在吃的過程中鈣信號上調(diào),，有10%的神經(jīng)元鈣信號下調(diào)（圖9）。

圖9 CeA中Htr2a 神經(jīng)元在全部進食行為中鈣信號的變化,。h圖展示了兩只小鼠的鈣信號變化,，可以看出在進食行為中，鈣信號均有明顯升高,。i圖是鈣信號有明顯的上調(diào)的小鼠在進食過程中的平均變化,。j圖是平均變化的幅度。k圖展示了鈣信號上調(diào)與下調(diào)對應(yīng)的小鼠所占的比例,。

為了進一步研究CeA中Htr2a 神經(jīng)元究竟參與編碼進食欲望（appetitive aspect）還是執(zhí)行進食（consummatory）,，作者使用了鼻觸獲得食物的實驗。通過分析鼻觸行為前后鈣信號變化,，和獲得食物進食前后的鈣信號變化,，他們發(fā)現(xiàn)只有在開始進食，鈣信號才會上升,，并且有些細胞的鈣信號變化是幾乎與進食動作同步（time-locked to eating start）,，有些細胞是稍有延遲鈣信號再上升（delayed onset）。還有些細胞在前一半實驗過程中并沒有反應(yīng)，而在后一半出現(xiàn)了有延遲的鈣信號上升現(xiàn)象（圖10）,。這部分結(jié)果證明了這群細胞是參與進食動作,，而不參與編碼獲取食物以及處理食物對應(yīng)cue的過程。

圖10 在鼻觸獲取食物實驗中CeA中Htr2a 神經(jīng)元的鈣活性變化,。m圖上方是平均鈣反應(yīng)，在鼻觸行為以及給予食物前的聲音cue前后,，鈣信號并沒有明顯變化,，下方是每個trial過程的鈣信號變化。n圖在開始吃食物后,，鈣信號明顯上升,。o圖是舉例一只小鼠記錄到的細胞在一次trial中的鈣信號變化。p圖為幾個代表性細胞的鈣信號變化,，其中cell2是明顯的與動作完全一致的類型,，而cell4是鈣信號明顯具有延遲的后升高的類型。

這些在體鈣成像的數(shù)據(jù)提供了CeA中Htr2a 神經(jīng)元參與進食行為的重要在體證據(jù),。

食物本身是一種reward信號,，是不是CeA中的Htr2a 神經(jīng)元其實參與的是reward獲得的過程。作者發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)元可以誘導(dǎo)條件位置選擇偏好,，同時鼻觸獲得光刺激這群神經(jīng)元的實驗組也比對照組明顯多的自發(fā)出現(xiàn)鼻觸行為,。這些結(jié)果證明了激活CeA中的Htr2a 神經(jīng)元是一種正強化（positivelyreinforcing）的作用。而光遺傳抑制這群神經(jīng)元則會降低小鼠為獲得食物的努力,。

之后他們用腦片電生理的方法證明了CeA的Htr2a 神經(jīng)元可以和PKCδ神經(jīng)元產(chǎn)生抑制性突觸聯(lián)系,。從而找到了一條可能參與進食行為的CeA內(nèi)部的微環(huán)路。而通過rabies病毒的方法,，也證明了這兩類細胞之間存在相互投射（圖11）,。

圖11 在急性分離腦片上，證明了CeA的Htr2a 神經(jīng)元可以和PKCδ神經(jīng)元產(chǎn)生抑制性突觸聯(lián)系,。

而真正可能參與調(diào)控進食過程的是從CeA的Htr2a 神經(jīng)元到腦干臂旁核PBN的投射,。通過光遺傳激活這條投射，他們發(fā)現(xiàn)了小鼠進食量的增加和條件位置選擇偏好的現(xiàn)象,，這提示我們之前激活Htr2a 神經(jīng)元胞體的現(xiàn)象很可能是通過這條環(huán)路發(fā)揮作用的,。當然，現(xiàn)在的實驗證據(jù)并不能排除是刺激末梢導(dǎo)致動作電位回傳引發(fā)胞體興奮的可能,，所以我認為還需要補充兩個實驗,。第一個是在CeA混合注射DIO-ChR2與DIO-hM4Di病毒，在激活投射的同時抑制CeA胞體的實驗作為對照,。第二個是在CeA注射DIO-ChR2病毒,，在PBN注射hSyn-hM4Di病毒，在激活投射的同時抑制PBN的胞體,。只有得到這兩個實驗結(jié)果,，才能確定是這條投射的功能（圖12）,。

圖12 CeA的Htr2a 神經(jīng)元向PBN的投射可能調(diào)節(jié)進食行為。

最后,，作者比較了CeA中Htr2a 神經(jīng)元的輸入與只投射到PBN的Htr2a 神經(jīng)元的輸入之間的差異,，他們發(fā)現(xiàn)投射到PBN的神經(jīng)元的上游包括弓狀核，parasubthalamic nucleus （PSTN）,，多巴胺系統(tǒng)的部分腦區(qū)等,。而全部Htr2a 神經(jīng)元的上游還包括島葉皮層（insular cortex），gustatory thalamus（VPMpc）,，背側(cè)raphe等區(qū)域（圖13）,。

圖13 投射到PBN的Htr2a 神經(jīng)元的上游與全部Htr2a 神經(jīng)元的上游比較。

總結(jié)這篇文章,，我們知道中央杏仁核中表達Htr2a的神經(jīng)元以及它的可能的環(huán)路是如何調(diào)節(jié)進食行為的,。文章使用的藥理學(xué)與光遺傳學(xué)技術(shù)，rabies逆標技術(shù)都比較熟悉,，文章中真正的技術(shù)亮點則是Inscopix nVista神經(jīng)元超微鈣離子成像技術(shù),。                       

看到這里，你有沒有心動,？

還想用c-Fos蛋白來證明你關(guān)心的腦區(qū)活性,？這已經(jīng)遠遠不夠了，必須要在體的證據(jù),。

Inscopix nVista神經(jīng)元超微鈣離子成像技術(shù)的幾大優(yōu)勢將助力您研究的科學(xué)問題,，不要讓CNS與您插肩而過！

參考文獻:

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