一、神經(jīng)元鈣信號(hào)及鈣成像技術(shù)基本原理

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號(hào)分子其作用具有時(shí)間性和空間性,。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)細(xì)胞興奮時(shí),，產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng)，此時(shí),，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi),，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合,，促使這一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng),。以此類推，神經(jīng)信號(hào)便一級(jí)一級(jí)地傳遞下去,，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)體系,，最終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級(jí)功能,。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中,，鈣離子同樣扮演著重要的信號(hào)分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM,，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,，增加的鈣離子對(duì)于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過(guò)程必不可少。眾所周知,，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性,，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時(shí)也受鈣結(jié)合蛋白的影響,。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體,、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時(shí)受體電位C型通道（TRPC）等,。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過(guò)熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái)，以反映神經(jīng)元活性,。該方法可以同時(shí)觀察多個(gè)功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞,。

二、利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動(dòng)

隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展,，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況,。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號(hào)和生理現(xiàn)象耦合起來(lái)——通過(guò)熒光染料信號(hào)的改變反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度,，以此代表細(xì)胞的功能狀態(tài),。目前它被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化,，從而判斷其功能活動(dòng)。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號(hào)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時(shí)間和空間上的傳遞穿梭,。

三,、神經(jīng)元鈣信號(hào)（Neuronal Calcium Signaling）

鈣離子內(nèi)流主要通過(guò)AMPA和NMDA谷氨酸受體、電壓門控鈣通道（VGCC）,、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時(shí)受體電位C型通道（TRPC）,；細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的鈣釋放主要由IP3R和RyR介導(dǎo)；鈣離子外流則由膜鈣ATP酶（PMCA）,、Na -Ca2 質(zhì)子泵（NCX）及薩爾科/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶（SERCA）介導(dǎo),；線粒體在維持神經(jīng)元鈣離子穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

四,、鈣離子指示劑（Calcium Indicators）

目前可用的指示劑較多,，根據(jù)熒光光譜、與鈣離子親和力及其化學(xué)特性的不同大致分為化學(xué)性鈣離子指示劑和基因編碼鈣離子指示劑,。前者指可特異性與鈣離子結(jié)合的小分子,，常用的有fura-2、indo-1等,；而后者主要指來(lái)源于綠色熒光蛋白GFP及其變異體的蛋白質(zhì),，可與鈣調(diào)蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶M13域結(jié)合，常用的有GCaMP,、TN-XXL等,，其中GCaMP5G和GCaMP6被廣泛應(yīng)用于在體鈣成像研究中。

A 生物熒光蛋白：Aequorin是水母熒光素（coelenterazine）通過(guò)硫酸酯鍵或過(guò)氧化鍵緊緊連到脫輔水母發(fā)光蛋白上形成的,，遇到鈣離子就發(fā)出470nm藍(lán)光,，可以作為鈣離子的檢測(cè)試劑；

B 化學(xué)鈣離子指示劑：Fura-2可在紫外光下被激活且發(fā)射出505-520nm光,；

C 基于FRET的基因編碼的鈣指示劑,；

D 單個(gè)熒光基因編碼的鈣指示劑。

五,、指示劑是如何負(fù)載細(xì)胞

目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法,，且都可以用于體內(nèi)和體外研究,。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個(gè)神經(jīng)元中,。此方法方便實(shí)驗(yàn)者控制單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負(fù)載神經(jīng)元,，觀察對(duì)象為一群神經(jīng)元,。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細(xì)胞也被指示劑所標(biāo)記，但大大提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比,，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動(dòng)作電位相關(guān)性的活動(dòng),。第三種也較為常用,，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。

（A）單細(xì)胞注射法,；（B）network loading法,；（C）通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑（expression of genetically encoded calcium indicators, GECI）

六、鈣離子光學(xué)信號(hào)采集裝置

（A和B）具有光電二級(jí)管陣的寬場(chǎng)顯微鏡,；（C和D）激光掃描顯微鏡：C 共聚焦顯微鏡,，D 雙光子顯微鏡；（E和F）應(yīng)用于無(wú)頭部固定裝置的行為動(dòng)物的鈣離子成像裝置

單光子顯微技術(shù)是最成熟的熒光顯微技術(shù),，但由于其使用的激發(fā)光波長(zhǎng)較短,，成像深度有限；能量較大,會(huì)造成對(duì)熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重,。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小, 實(shí)現(xiàn)樣本三維成像要逐點(diǎn)掃描,成像速度慢,對(duì)樣本損害大,很難用于長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像,。而寬場(chǎng)顯微鏡能夠很好地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像,光漂白小, 因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，但寬場(chǎng)顯微鏡由于離焦信號(hào)的干擾,難以實(shí)現(xiàn)多維成像,。

雙光子熒光顯微鏡（Two-Photon Laser-Scanning Microscopy）,。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學(xué)成像方法,采用長(zhǎng)波激發(fā)，能對(duì)組織進(jìn)行深層次成像,。常用的最佳激發(fā)波長(zhǎng)大多位于800-900nm,，而水、血液和固有組織發(fā)色團(tuán)對(duì)這個(gè)波段的光吸收率低,，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品,，因此背景第，光損傷小,，適用于在體檢測(cè),。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)置入的微電極位置，從而觀察胞體,、樹突甚至單個(gè)樹突棘的活性,。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的高分辨熒光圖像, 甚至可以分辨神經(jīng)細(xì)胞單個(gè)樹突棘中的鈣分布。

七,、鈣成像技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用

1,、記錄體外培養(yǎng)的神經(jīng)元的活動(dòng)

2、記錄腦片上的神經(jīng)元的活動(dòng)

3,、在體記錄神經(jīng)元樹突和樹突棘的活動(dòng)

4,、不同動(dòng)物模型的環(huán)路分析

5、行為動(dòng)物中的鈣離子成像研究