NGS腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)

樣本類型：組織樣本（新鮮組織+石蠟切片）以及cfDNA樣本

     可查閱2017年 FDA批準(zhǔn)的FoundationOne CDx?和MSK-IMPACT兩個(gè)組織樣本大Panel以及2018年CFDA批準(zhǔn)的國(guó)內(nèi)幾個(gè)小Panel的相關(guān)產(chǎn)品說(shuō)明,。另外對(duì)于cfDNA血漿樣本,，目前除EGFR基因外，尚未有相關(guān)產(chǎn)品獲批,。

接下來(lái)從樣本類型入手,，對(duì)這兩種類型樣本相關(guān)NGS產(chǎn)品的主要注意事項(xiàng)進(jìn)行說(shuō)明：

一. 腫瘤組織樣本WGS/WES/靶向 Panel測(cè)序產(chǎn)品：        

Part1----測(cè)序前：該產(chǎn)品/公司能否提供以下十一項(xiàng)內(nèi)容或說(shuō)明？

（1.1）該產(chǎn)品是否包含腫瘤純度評(píng)估內(nèi)容：

        腫瘤組織是不同亞型的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的混合物,，原始送檢樣本中腫瘤細(xì)胞比例直接決定著最終檢測(cè)結(jié)果,，尤其是因腫瘤細(xì)胞比例過(guò)低（<10%，MSK-IMPACT）時(shí)帶來(lái)的假陰性結(jié)果,。所以不管是WES/WGS還是Panel靶向測(cè)序,，在交付測(cè)序分析結(jié)果的同時(shí)也應(yīng)提供腫瘤純度評(píng)估結(jié)果；

（1.2）該產(chǎn)品是否為Tumor/Normal配對(duì)檢測(cè)：

      Tumor only型產(chǎn)品雖然報(bào)價(jià)低,，但大部分公司下游生信分析方法尚不成熟,，除了Foundation Medicine的Tumor only分析方法獲FDA批準(zhǔn)認(rèn)可外，其它相關(guān)公司更多是出于控制成本和占領(lǐng)市場(chǎng)而非檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的角度考慮,。

（1.3）該P(yáng)anel設(shè)計(jì)的內(nèi)含子區(qū)域及建庫(kù)測(cè)序方法 (見(jiàn)圖1)：

      Panel產(chǎn)品中內(nèi)含子區(qū)域的有無(wú)以及內(nèi)含子位置和數(shù)目決定了能不能進(jìn)行DNA層面的融合基因檢測(cè)以及融合基因檢測(cè)結(jié)果的可靠性；

      建庫(kù)測(cè)序方法---擴(kuò)增子建庫(kù)or雜交捕獲建庫(kù)：基于雜交捕獲法得到的NGS測(cè)序數(shù)據(jù)相較于擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)往往具有較好的均一性,，有利于下游生信分析,，尤其是拷貝數(shù)變異和融合基因的檢測(cè)；同時(shí)擴(kuò)增子Panel增加或刪減個(gè)別基因都會(huì)影響到全局的引物擴(kuò)增效率,，對(duì)于臨時(shí)增加或減少擴(kuò)增子Panel中基因數(shù)目的操作需要慎重對(duì)待,；

（1.4）該產(chǎn)品的測(cè)序深度與突變檢測(cè)下限：

      Panel組織樣本的測(cè)序深度：（質(zhì)控后clean data）在500X~1000X之間即可,，隨著測(cè)序深度增加，引入PCR重復(fù)序列的比例也隨之升高,，無(wú)效數(shù)據(jù)大幅增加,，對(duì)于體細(xì)胞突變檢測(cè)意義不大；

      突變檢測(cè)下限：不管是1%,，還是5‰,，請(qǐng)對(duì)方同時(shí)提供該檢測(cè)下限的突變r(jià)eads支持?jǐn)?shù)目；

（1.5）該產(chǎn)品轉(zhuǎn)產(chǎn)前的驗(yàn)證報(bào)告：

      根據(jù)該產(chǎn)品轉(zhuǎn)產(chǎn)前用于驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)品基因數(shù)目,、突變位點(diǎn)數(shù)目,，QC，數(shù)據(jù)覆蓋度均一性,，人員操作的精密度以及驗(yàn)證結(jié)果的PPV,NPV等情況對(duì)該產(chǎn)品性能有基本了解,。

（1.6） 該產(chǎn)品檢測(cè)內(nèi)容：

        一個(gè)設(shè)計(jì)良好的組織樣本NGS產(chǎn)品可以對(duì)點(diǎn)突變（SNV）、插入缺失          （insert/deletion）,、拷貝數(shù)變異（CNV）,，基因融合，微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）五部分內(nèi)容進(jìn)行檢測(cè),，而且每部分都應(yīng)有對(duì)應(yīng)的檢測(cè)下限,；

       此外，對(duì)于具有家族病史的腫瘤患者,，還應(yīng)將其體細(xì)胞突變和配對(duì)的Normal樣本中的germline突變結(jié)合起來(lái)進(jìn)行分析,，去年癌癥癌癥圖譜計(jì)劃發(fā)表的兩篇文章進(jìn)一步顯示癌癥患者中存在germline致病突變的比例（~8%）不容忽視：見(jiàn) cell1,cell2，進(jìn)一步回應(yīng)了經(jīng)典的腫瘤二次打擊學(xué)說(shuō),這就是經(jīng)典學(xué)說(shuō)的魅力吧,！

(1.7)  該產(chǎn)品變異檢測(cè)的其它備選方法（見(jiàn)圖2）：

      目前不同主流體細(xì)胞突變檢測(cè)軟件的突變檢出一致率并不高,，非主流突變檢測(cè)軟件更難稱得上靠譜，所以重要項(xiàng)目同時(shí)用兩套以上分析方法進(jìn)行分析還是有必要的,。

(1.8)  技術(shù)人員資質(zhì)及用藥數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)及更新情況

      避免自己成為----專業(yè)背景不對(duì)口,、缺乏相關(guān)工作經(jīng)驗(yàn)的后臺(tái)技術(shù)人員推出的這個(gè)新產(chǎn)品的小白鼠；

(1.9) 建庫(kù)前的捕獲測(cè)序以及樣本特性（FFPE石蠟切片）等引入的假陽(yáng)性突變

       高深度的靶向捕獲測(cè)序探針覆蓋的均一性,、捕獲過(guò)程中的DNA損傷以及FFPE樣本（比如2年以上）的處理和儲(chǔ)存過(guò)程引起的核酸損傷和降解,，導(dǎo)致的生信分析結(jié)果中出現(xiàn)大量的GA/CT假陽(yáng)性突變,以及與測(cè)序平臺(tái)相關(guān)的背景噪音--大量樣本中普遍存在的低豐度突變，如何解決,？

（1.10）有沒(méi)有定期的質(zhì)量驗(yàn)證和糾正措施

        基因測(cè)序公司的人員流動(dòng)性普遍比較大,，即便以上內(nèi)容全都做的很到位，還需要有良好的規(guī)章制度,，比如定期的自行驗(yàn)證報(bào)告,，以保證不同人員批次產(chǎn)品結(jié)果的穩(wěn)定；

（1.11） X10測(cè)序平臺(tái)的同line污染如何應(yīng)對(duì)

     大部分小公司都會(huì)把測(cè)序業(yè)務(wù)外包給具有 illumina X10測(cè)序平臺(tái)的大公司,，但X10平臺(tái)建庫(kù)過(guò)程中樣本預(yù)混合時(shí)間相對(duì)其它測(cè)序平臺(tái)較長(zhǎng),，同一條line的不同樣本在預(yù)混合過(guò)程中barcode脫落引起的樣本間的相互污染( 但不確定后來(lái)illumina很快推出的Novoseq平臺(tái)是否已經(jīng)解決該問(wèn)題）,如何應(yīng)對(duì),？

圖1:不同建庫(kù)方式對(duì)腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)的影響：來(lái)源：https://max.book118.com/html/2017/0703/120032109.shtm

圖2：不同體細(xì)胞突變分析軟件gDNA檢出結(jié)果一致性比較:來(lái)源：https://www./articles/srep36540

Part2---測(cè)序后：樣本質(zhì)控信息及突變注釋數(shù)據(jù)庫(kù)版本

（2.1）組織樣本測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控信息應(yīng)包括：

        a. 插入片段長(zhǎng)度的均值/中位數(shù)；b. GC比例及均一性分布圖,；c. 樣本間交叉污染評(píng)估（防止錯(cuò)配及其它樣本污染）,；d. bam文件靶區(qū)域覆蓋度的均值/中位數(shù)；e. 其它Q30等指標(biāo)

（2.2） 用于突變注釋的數(shù)據(jù)庫(kù)版本

        COSMIC/ClinVar等重要數(shù)據(jù)庫(kù)每年都會(huì)更新多版,，這些數(shù)據(jù)庫(kù)直接影響著突變致病性的解讀,，需要及時(shí)更新，另外也需要及時(shí)引入其它數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)常規(guī)數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄的非同義突變的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè),。

 二. cfDNA樣本Panel產(chǎn)品

 Part1----測(cè)序前：該cfDNA產(chǎn)品是否能提供以下十項(xiàng)檢測(cè)內(nèi)容或說(shuō)明：

2.1. 獲得CAP/CFDA認(rèn)證資格的公司與其產(chǎn)品靠譜的相關(guān)性有多大,？

     一方面用于CAP/CFDA認(rèn)證考試的標(biāo)準(zhǔn)品位點(diǎn)的突變頻率相對(duì)較高；另一方面任何一家公司都會(huì)不計(jì)成本地投入人力,、物力做好標(biāo)準(zhǔn)品以拿到這些證書,；最后標(biāo)準(zhǔn)品跟實(shí)際樣本往往區(qū)別很大，所以拿到這些證就像考研過(guò)了國(guó)家線,，與其實(shí)際科研解決問(wèn)題的能力不存在必然聯(lián)系,；

2.2. 采血比采組織樣本方便，直接用血液樣本的NGS結(jié)果代替組織樣本,？

      發(fā)文章可以,，做biomarker篩選最好不要這樣干，2018年的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的cfDNA和組織樣本體TMB/bTMB的一致性也僅在0.64左右,，其突變位點(diǎn)檢出的一致性更低,，建議有組織樣本就盡量用組織樣本。2017年對(duì)國(guó)外主流ctDNA公司檢測(cè)結(jié)果的比較的研究報(bào)道以及2018年ASCO發(fā)布的ctDNA相關(guān)的臨床建議,，都顯示當(dāng)前業(yè)內(nèi)對(duì)腫瘤ctDNA的臨床應(yīng)用價(jià)值還存在不少爭(zhēng)議,。

2.3.   樣本融血影響大不大？

     輕度溶血需標(biāo)記備注,，中度以及重度融血影響檢測(cè)結(jié)果,，須重新送樣，此外血樣處理時(shí)間,，采樣管材質(zhì)等眾多因素都會(huì)影響到ctDNA的檢測(cè)結(jié)果,。

2.4. 是否需要血漿/白細(xì)胞配對(duì)檢測(cè)？

     當(dāng)前那些聲稱可以對(duì)cfDNA血漿樣本進(jìn)行非配對(duì)檢測(cè)的都是耍流氓,；

2.5. cfDNA樣本的WGS/WES產(chǎn)品是否靠譜,？

       某些癌種在科研上有對(duì)cfDNA進(jìn)行WGS/WES測(cè)序分析的例子，但實(shí)際生產(chǎn)中必然存在較大范圍漏點(diǎn)（捕獲不到,，測(cè)不到）的情形,；

2.6. cfDNA/組織樣本體細(xì)胞突變檢測(cè)是否同時(shí)應(yīng)設(shè)置檢測(cè)上限 [見(jiàn)圖3]？

       由于腫瘤組織的異質(zhì)性，攜帶特定體細(xì)胞突變的腫瘤細(xì)胞在組織中的占比介于0%-100%之間,，因此不管是cfDNA還是組織樣本，從保證結(jié)果特異性的角度出發(fā)對(duì)體細(xì)胞突變?cè)O(shè)置檢測(cè)下限是有必要的,，但是設(shè)置檢測(cè)上限是沒(méi)有根據(jù)的,，其背后可能反映著生信分析流程的bug以及后臺(tái)技術(shù)人員的不專業(yè);

2.7. cfDNA Panel建庫(kù)測(cè)序的UMI分子標(biāo)簽及測(cè)序深度

       cfDNA必須加UMI建庫(kù)測(cè)序（組織則樣本沒(méi)必要），以減少低頻突變假陽(yáng)性位點(diǎn)的干擾,，另外UMI深度及支持?jǐn)?shù)目應(yīng)體現(xiàn)在下游質(zhì)控分析和變異檢測(cè)結(jié)果中,；

       根據(jù)2016年的文獻(xiàn)及業(yè)內(nèi)主流公司產(chǎn)品，cfDNA樣本測(cè)序深度應(yīng)在20,000X以上,；

2.8.  請(qǐng)對(duì)方同時(shí)提供cfDNA產(chǎn)品轉(zhuǎn)產(chǎn)前驗(yàn)證報(bào)告及ctDNA與組織樣本突變檢測(cè)一致性報(bào)告

       GIAB官網(wǎng)提供的標(biāo)準(zhǔn)品中的已知位點(diǎn)畢竟有限,，有一定樣本積累公司會(huì)對(duì)ctDNA與組織樣本突變檢出一致率進(jìn)行比較，從整體層面對(duì)自己cfDNA產(chǎn)品做一個(gè)評(píng)估,；

2.9.  請(qǐng)對(duì)方提供白細(xì)胞克隆造血等特殊情況的解決方案

        約5%~10%的老年人會(huì)發(fā)生克隆性造血---血液中存在低豐度的克隆性造血相關(guān)基因突變,，這些突變往往難以與腫瘤特有突變進(jìn)行區(qū)分；

2.10. 請(qǐng)對(duì)方提供檢測(cè)內(nèi)容及各項(xiàng)檢測(cè)內(nèi)容的檢測(cè)下限

       目前無(wú)法從cfDNA層面檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）,在拷貝數(shù)變異（CNV）檢測(cè)方面也無(wú)法通過(guò)評(píng)估cfDNA中ctDNA比例來(lái)估計(jì)腫瘤細(xì)胞占比,；其它基因融合及insert/deletion檢測(cè)也往往沒(méi)有組織樣本準(zhǔn)確,；

圖3：腫瘤組織異質(zhì)性：來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)

 Part2: 測(cè)序后：數(shù)據(jù)質(zhì)控及突變檢測(cè)結(jié)果IGV驗(yàn)證

數(shù)據(jù)質(zhì)控：除reads測(cè)序深度外，必須同時(shí)提供UMI深度信息,，其它質(zhì)控條件同組織樣本,；

突變檢測(cè)結(jié)果IGV驗(yàn)證：cfDNA突變檢測(cè)難度較大，結(jié)果容易出現(xiàn)假陽(yáng)性突變,，因此對(duì)于最終檢測(cè)結(jié)果的可靠性,，需同時(shí)索要用于變異檢測(cè)的bam及索引文件，在windows本地安裝的IGV基因組瀏覽器上對(duì)SNV/INDEL以及融合基因進(jìn)行驗(yàn)證,，最后突變注釋相關(guān)注意事項(xiàng)同組織樣本,。

三. 實(shí)際項(xiàng)目中的一些常見(jiàn)疑問(wèn)

Q1: 同一個(gè)病人不同時(shí)間點(diǎn)上的體細(xì)胞突變檢測(cè)，配對(duì)Normal樣本是否需要多次采樣測(cè)序,？

        對(duì)于具備較好技術(shù)積累和運(yùn)營(yíng)透明度的測(cè)序公司,，Normal樣本的germline突變?cè)诓煌谓◣?kù)測(cè)序分析中不會(huì)有大的起伏，配對(duì)Normal樣本只測(cè)一次即可,；

Q2:同一個(gè)病人在不同時(shí)間點(diǎn)上cfDNA樣本的體細(xì)胞突變檢測(cè)結(jié)果無(wú)交集,？

      同一個(gè)cfDNA樣本不同文庫(kù)的測(cè)序分析結(jié)果是會(huì)存在差異，但是如果入組的多個(gè)個(gè)體都在不同時(shí)間點(diǎn)上的體細(xì)胞突變都沒(méi)有交集,，則需考慮質(zhì)控以及該產(chǎn)品是否存在bug,，可換一家公司對(duì)原始數(shù)據(jù)重新分析；

Q3： 結(jié)題報(bào)告中的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及預(yù)想結(jié)果出入較大：

      不用急著否定自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),，先把原始數(shù)據(jù)換一家公司重新分析一遍,，著重比較數(shù)據(jù)質(zhì)控和突變檢測(cè)兩部分內(nèi)容；

Q4：Panel大小與TMB及突變檢出數(shù)目的相關(guān)性？（見(jiàn)圖4）

        如圖4所示：外顯子總長(zhǎng)度在1Mb以上（基因數(shù)目約300個(gè)以上）的Panel,，其TMB值與WES數(shù)據(jù)有較好的一致率,。同時(shí)大Panel在腫瘤純度、染色體倍性評(píng)估以及相關(guān)的拷貝數(shù)變異分析上也會(huì)有較準(zhǔn)確的結(jié)果,；

Q5: 關(guān)于合同上經(jīng)常出現(xiàn)的數(shù)據(jù)量及測(cè)序深度：

      一味吹噓測(cè)序數(shù)據(jù)量大,、測(cè)序深度高的的產(chǎn)品往往水分比較大--這是實(shí)在拿不出其它硬性技術(shù)指標(biāo)的節(jié)奏；另外對(duì)于測(cè)序深度,，最好分清楚是raw data,、clean data、重后的bam文件還是UMI深度這四個(gè)中的哪一個(gè),；

Q6: 腫瘤驅(qū)動(dòng)突變,、免疫組庫(kù)技術(shù)、腫瘤疫苗,、ctDNA甲基化早篩等前沿技術(shù)產(chǎn)品,？

       及時(shí)跟進(jìn)，暫不做評(píng)價(jià)

圖4：Panel大小與TMB相關(guān)性：來(lái)源文獻(xiàn)：https://www./articles/s41591-018-0134-3

      NGS腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)部分的注意事項(xiàng)暫且寫到這里,，相關(guān)內(nèi)容會(huì)持續(xù)更新,，RNA-seq及溶瘤病毒denovo組裝部分內(nèi)容見(jiàn)后續(xù)章節(jié)。希望能對(duì)藥企/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中涉及NGS的相關(guān)研究有所幫助,。同時(shí)也歡迎大家交流執(zhí)指正,！

 寫于 2019年3月12日夜