作者：沈立松 王維維 袁向亮

選自：中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2016,39(05): 329-331. 

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是一種能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞或生物微顆粒的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段,，具有快速,、高精度、高準(zhǔn)確性,、多參數(shù)和高通量等優(yōu)點(diǎn),，是目前先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一^[1,2,3]。近年來(lái),，F(xiàn)CM的發(fā)展日新月異,，技術(shù)不斷有新的突破，新型儀器不斷涌現(xiàn),，同時(shí),，F(xiàn)CM在醫(yī)學(xué)及其他科學(xué)的應(yīng)用更加廣泛和深入，涵蓋了從基礎(chǔ)研究到臨床診斷的多個(gè)方面,，涉及免疫學(xué),、血液學(xué)、腫瘤學(xué)等^[3,4,5],。

一,、我國(guó)流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

我國(guó)流式細(xì)胞儀的研制和流式細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用歷經(jīng)30多年的發(fā)展，在臨床和科研領(lǐng)域的應(yīng)用都發(fā)揮了非常重要的作用,。

1.流式細(xì)胞儀的使用現(xiàn)狀：

流式細(xì)胞儀首先是由科學(xué)研究單位引進(jìn)我國(guó),，逐漸進(jìn)入到醫(yī)療系統(tǒng)，應(yīng)用于臨床,。2011年有學(xué)者就我國(guó)流式細(xì)胞儀的應(yīng)用情況做過(guò)調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，單色,、雙色,、三色及四色熒光標(biāo)記分別占15.4% (53/344)、13.7% (47/344),、54.1%(186/344)及16.3%(56/344)^[6],，仍以單激光較少熒光通道的儀器為主。

2.流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的現(xiàn)狀：

目前我國(guó)FCM應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在下列方面(在此僅列出部分代表項(xiàng)目)：(1)免疫學(xué)領(lǐng)域：淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè),，用以評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài),、輔助疾病如AIDS/HIV的診斷等，是目前各醫(yī)療單位開(kāi)展和應(yīng)用最廣泛的項(xiàng)目,。(2)血液學(xué)領(lǐng)域：主要是血液系統(tǒng)疾病的免疫分型及白血病微小殘留病變(minimal residual disease,，MRD)監(jiān)測(cè),，用于血液系統(tǒng)疾病的診斷、治療評(píng)估和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè),。FCM的細(xì)胞免疫分型是國(guó)際公認(rèn)的診斷造血細(xì)胞疾病必不可少的重要標(biāo)準(zhǔn)之一,，是目前被廣泛接受和認(rèn)可的免疫分型方法^[7,8]。(3)臨床腫瘤學(xué)：主要是DNA倍體和細(xì)胞周期分析,，了解細(xì)胞DNA倍體和增殖能力,，異常倍體的出現(xiàn)意味著DNA合成的異常，可能是腫瘤或是癌前病變發(fā)生的重要標(biāo)志,。(4)造血干細(xì)胞移植的應(yīng)用：足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞是造血干細(xì)胞移植成功的關(guān)鍵因素之一,，通過(guò)CD34標(biāo)記和細(xì)胞計(jì)數(shù)微球同時(shí)使用，或者具有計(jì)數(shù)功能的流式細(xì)胞儀是鑒定和計(jì)數(shù)造血干細(xì)胞的快速,、準(zhǔn)確,、定量的方法。

二,、流式細(xì)胞術(shù)的近期進(jìn)展

1．流式細(xì)胞儀的進(jìn)展：

近年來(lái),，流式細(xì)胞儀性能不斷提升，體現(xiàn)在分析速度的提高,、靈敏度和精密度的提升,，以及激光通道和參數(shù)的增多。此外,，流式細(xì)胞儀不斷打破傳統(tǒng)的界限,，實(shí)現(xiàn)了多學(xué)科的交叉發(fā)展，誕生了一些新理念,、新技術(shù)融合的儀器,。例如，微流控芯片流式細(xì)胞儀,，是基于微機(jī)電技術(shù)的一種小型流式細(xì)胞儀,，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便,、體積小,、價(jià)格低廉等特點(diǎn)^[9,10]；聲波聚焦流式細(xì)胞儀是采用超聲波原理將細(xì)胞聚焦于流動(dòng)室的中軸上,，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的流體動(dòng)力,，實(shí)現(xiàn)高通量、高精確度分析,；質(zhì)譜流式細(xì)胞儀將傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀與質(zhì)譜分析技術(shù)相結(jié)合,，采用同位素標(biāo)記特異性抗體，利用質(zhì)譜原理對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)的流式技術(shù)，可以克服熒光素發(fā)光光譜相互干擾導(dǎo)致的波譜重疊,、影響分辨的問(wèn)題,；將傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀的熒光信號(hào)與熒光顯微鏡的形態(tài)學(xué)結(jié)合，形成了成像流式細(xì)胞儀,，檢測(cè)者可以目睹到每個(gè)細(xì)胞或顆粒的形態(tài),。質(zhì)譜流式細(xì)胞儀和成像流式細(xì)胞儀可以被稱為二代流式細(xì)胞儀^[11]。

2．流式細(xì)胞新技術(shù)的進(jìn)展：

FCM主要分析熒光標(biāo)記的細(xì)胞和顆粒,，也是目前廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域,。但是，新近研究打破了這一界限,，實(shí)現(xiàn)了流式細(xì)胞儀由檢測(cè)熒光標(biāo)記的細(xì)胞,，到可以檢測(cè)無(wú)需熒光標(biāo)記細(xì)胞的飛躍，這種技術(shù)對(duì)細(xì)胞無(wú)損壞,、避免了熒光染料的干擾^[12],，將進(jìn)一步提升流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍和價(jià)值。有學(xué)者研究出一種新的流式細(xì)胞技術(shù)^[13,14],，稱為實(shí)時(shí)變形性流式細(xì)胞術(shù)(real-time deformability cytometry,，RT-DC)，利用腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞的內(nèi)在特性——變形能力,，對(duì)無(wú)標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞分析,，這種無(wú)標(biāo)記的分析方法為流式細(xì)胞分析增加了新的可能。

3．流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展：

隨著時(shí)間的推移,，F(xiàn)CM應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大,，新的一些臨床檢測(cè)和科研項(xiàng)目也在不斷開(kāi)發(fā)。

流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用范圍的擴(kuò)展：FCM的檢測(cè)生物物種不限于人類,，也包括其他的物種,，如動(dòng)物^[15]、植物^[16,17]等,。FCM所能檢測(cè)的標(biāo)本也不僅限于外周血和骨髓,、淋巴結(jié)、淋巴瘤和實(shí)體組織,，還可以檢測(cè)灌洗液^[18],、胸腹水^[19,20]等；關(guān)于FCM的應(yīng)用領(lǐng)域,，筆者^[4,5]曾介紹擴(kuò)展到了生殖領(lǐng)域，如精子^[21,22,23]和胚胎^[15]的檢測(cè)等并日臻成熟,。

流式細(xì)胞術(shù)新項(xiàng)目的研發(fā)：(1)實(shí)體瘤的鑒定與監(jiān)測(cè)：實(shí)體瘤(如神經(jīng)母細(xì)胞瘤,、腎母細(xì)胞瘤等)是非血液來(lái)源的一類異質(zhì)性腫瘤，是嬰幼兒常見(jiàn)的惡性腫瘤,，其預(yù)后很大程度上依賴于腫瘤的早期診斷和治療,。以往,，此類疾病的診斷主要依賴于病理，但病理檢查耗時(shí)較長(zhǎng),，不利于疾病的快速診治,。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同類型的實(shí)體瘤免疫分型檢測(cè)，有助于實(shí)體瘤的快速分類鑒定和早期治療^[24],。(2)細(xì)胞新亞群的鑒定：①Th1,、Th2、Th17細(xì)胞的檢測(cè)：Th亞群細(xì)胞的平衡對(duì)于人體正常免疫應(yīng)答的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用,，各細(xì)胞亞群的失衡會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生,，如自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病,、腫瘤等,。②調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的檢測(cè)：Treg細(xì)胞是一群具有免疫抑制性的T細(xì)胞亞群，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮免疫抑制效應(yīng),，與Th細(xì)胞之間的平衡參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其標(biāo)記主要為CD4^＋CD25^＋FoxP3^＋或者CD4^＋CD25^＋CD127^low/-，有研究發(fā)現(xiàn)CD6^low可以作為Treg細(xì)胞的一個(gè)新的表面標(biāo)記,，此類細(xì)胞具有傳統(tǒng)Treg相似的抑制效應(yīng)^[25],。③調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)的檢測(cè)：Breg是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)和鑒定的一群具有調(diào)節(jié)功能的B淋巴細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用^[26],，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其標(biāo)記主要為CD19^＋CD5^＋CD1d^hi或者CD19^＋CD24^hiCD38^hi,。隨著流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用的不斷進(jìn)展，新的細(xì)胞亞群和新的指標(biāo)也將不斷的被發(fā)現(xiàn),。

三,、我國(guó)流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用面臨的問(wèn)題

我國(guó)FCM的應(yīng)用遲于國(guó)外近10年，發(fā)展時(shí)日尚短,，還面臨著許多不足,。

1. FCM設(shè)備和試劑的問(wèn)題：

流式細(xì)胞儀是高端精密儀器，要求使用者掌握和具備免疫學(xué),、血液學(xué),、分子生物學(xué)等多學(xué)科的知識(shí)和技術(shù)，且儀器價(jià)格昂貴,，這些因素阻礙了FCM在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用和普及,。FCM使用的試劑價(jià)格昂貴，也阻礙了項(xiàng)目的開(kāi)展和應(yīng)用,。而且,，國(guó)內(nèi)許多熒光抗體未獲得臨床使用許可證，僅可用于科研，因此,，許多檢測(cè)項(xiàng)目和指標(biāo)無(wú)法開(kāi)展,，不利于患者疾病的診治，阻礙了在相關(guān)臨床專業(yè)的發(fā)展,。

2．FCM質(zhì)量管理的問(wèn)題：

FCM質(zhì)量管理包括有效性控制,、質(zhì)量控制、能力驗(yàn)證,、標(biāo)準(zhǔn)操作流程的文件管理,、人員培訓(xùn)評(píng)估、質(zhì)量提升等^[27],。由于FCM具有多參數(shù)的特點(diǎn),，從標(biāo)本采集、處理到上機(jī),、分析是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程,，檢測(cè)標(biāo)本的采集運(yùn)輸與保存、流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)與性能,、所選擇試劑的質(zhì)量和搭配,、人員的素質(zhì)等都直接影響著檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量^[28,29]。

目前,，我國(guó)關(guān)于FCM的一些建議和標(biāo)準(zhǔn)在不斷的涌現(xiàn),，如《流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》(WS/T-360-2011)^[30]，《流式細(xì)胞術(shù)臨床應(yīng)用的建議》^[31],，《CD34陽(yáng)性細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定指南》^[32],。但是，我國(guó)FCM的質(zhì)量管理還處在起步階段,，衛(wèi)生部臨檢中心和上海市臨檢中心的室間質(zhì)評(píng)僅包含部分檢測(cè)項(xiàng)目^[28],；尚無(wú)專門的機(jī)構(gòu)對(duì)人員進(jìn)行培訓(xùn)和認(rèn)證；未形成全國(guó)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程和參考范圍,，缺乏可比性等,。這些都是FCM質(zhì)量管理應(yīng)用發(fā)展中面臨的問(wèn)題。

四,、展望

綜上所述,，我國(guó)FCM在臨床和科研中廣泛應(yīng)用，且在儀器和技術(shù)方面取得了一定的進(jìn)展,，但是也應(yīng)清楚的認(rèn)識(shí)到FCM的技術(shù)發(fā)展和臨床使用仍然有待日臻完善,。

參考文獻(xiàn)：略