l 流式細(xì)胞儀標(biāo)本制備的操作步驟與注意事項
(一) 原理
活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體,，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合,，根據(jù)所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布,。
(二) 操作步驟
制備活性高的細(xì)胞懸液(培養(yǎng)細(xì)胞系、外周血單個核細(xì)胞,、
胸腺細(xì)胞,、脾細(xì)胞等均可用于本法)
↓
用10％FCS RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為
5×10６～１×10７／ml
↓
取40μl細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb(5～50μl)
的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl 1∶20(用DPBS
稀釋)滅活正常兔血清
↓4℃ 30min
用洗滌液洗滌2次,，每次加洗滌液2ml左右
1000rpm×5min
↓
棄上清,，加入50μl工作濃度的羊抗鼠
(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物，充分振搖
↓ 4℃ 30min
用洗滌液洗滌2次,，每次加液2ml左右
1000rpm×5min
↓
加適量固定液(如為FCM制備標(biāo)本,，一般加入
1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察,，
視細(xì)胞濃度加入100～500μl固定液)
↓
FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察
(標(biāo)本在試管中可保存5～7天)
(三) 試劑和器材
1. 各種特異性單克隆抗體,。
2. 熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清,。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS,、洗滌液、固定液(見附錄),。
4. 玻璃管,、塑料管、離心機,、熒光顯微鏡等,。
(四) 注意事項
1. 整個操作在4℃下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaNO３,，上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián),、脫落。
2. 洗滌要充分,，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合,，出現(xiàn)假陰性。
3. 加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體,，降低和防止非特異性染色,。
4. 細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色,。
附:
1. DPBS (×10, 貯存液)
NaCl 80g
KCl 2g 蒸餾水加至1000ml
Na２HPO４ 11.5g 臨用時用蒸餾水1∶10稀釋
KH２PO４ 2g
2. 洗滌液
DPBS 900ml
FCS 50ml (終濃度 5％)
4％NaNO３ 50ml (終濃度0.2％)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖 20g (終濃度2％)
甲 醛 10ml
NaNO３ 0.2g (終濃度0.02％)
l 流式細(xì)胞術(shù)常規(guī)檢測時的樣品制備
(一)直接免疫熒光標(biāo)記法
取一定量細(xì)胞(約1X106細(xì)胞／ml),，在每一管中分別加入50μl的HAB,，并充分混勻，于室溫中靜置1分鐘以上(),再直接加入連接有熒光素的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)(如做雙標(biāo)或多標(biāo)染色,，可把幾種標(biāo)記有不同熒光素的抗體同時加入),，。孵育20-60分鐘后,，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入緩沖液重懸,，上機檢測,。本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確,，易于分析,，適用于同一細(xì)胞群多參數(shù)同時測定。雖然直標(biāo)抗體試劑成本較高,，但減少了間接標(biāo)記法中較強的非特異熒光的干擾,，因此更適用于臨床標(biāo)本的檢測。
(二)間接免疫熒光標(biāo)記法
取一定量的細(xì)胞懸液(約1X106細(xì)胞／ml),，先加入特異的第一抗體,，待反應(yīng)完全后洗去未結(jié)合抗體，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體,，生成抗原—抗體—抗抗體復(fù)合物,，以FCM檢測其上標(biāo)記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。本方法費用較低,，二抗應(yīng)用廣泛,，多用于科研標(biāo)本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體,，特異性較差,，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結(jié)果,。所以標(biāo)本制備時應(yīng)加入陰性或陽性對照,。另外，由于間標(biāo)法步驟較多,，增加了細(xì)胞的丟失,，不適用測定細(xì)胞數(shù)較少的標(biāo)本。
l 最小化非特異性結(jié)合的方法
1．熒光標(biāo)記的抗體的濃度應(yīng)該合適,，如果濃度過高,，背景會因為非特異性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗體之前,，將樣品與過量的蛋白一起培育,，如小牛血清蛋白（BSA）,，脫脂干奶酪，或來自于同一寄主的正常血清來作為標(biāo)記的第二抗體,。這個步驟通過阻斷第一抗體和細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非特異性的交互作用來降低背景,。
3．在使用第一抗體之后，將樣品與5%至10%的來自于同一寄主的正常血清和作為標(biāo)記的第二抗體一起培育,。這個步驟會減少不必要的第二抗體與第一抗體,、細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的交互作用。
通過用來自于同樣的樣品的血清稀釋標(biāo)記過的抗體可以略過此步驟,。此步驟適用于很多方面,，但有時候它也會導(dǎo)致已標(biāo)記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復(fù)合體的形成。這種復(fù)合體會優(yōu)先與一些細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合,，或者它們最終會導(dǎo)致期望得到的抗體活性的丟失,。
4．使用F(ab’)2片段會使背景決定于第一或第二抗體與FC受體的全分子結(jié)合。大多數(shù)的第二抗體的F(ab’)2片段容易利用,。而第一抗體的F(ab’)2片段一般是不能利用或很難制作,。因此，在NaN3存在的條件下,，將新鮮組織或細(xì)胞與正常血清一起培育應(yīng)選擇優(yōu)先加入第一抗體,。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子,，FC受體決定的背景影響已不再重要,。
5．其它：已標(biāo)記的抗體和其他一些內(nèi)在的免疫球蛋白或加入實驗系統(tǒng)中的其它物質(zhì)的交叉反應(yīng)也可能會有背景影響。為了降低背景,，在多重標(biāo)記過程中,，所有的已標(biāo)記的抗體應(yīng)被吸附，避免其他種類蛋白的交叉反應(yīng),。
