摘要

本文綜述了人工肝的特點,，包括利用體外裝置進(jìn)行“人工肝”或“生物型人工肝”進(jìn)行肝臟治療,。文獻(xiàn)數(shù)據(jù)分析顯示，需要進(jìn)一步進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究,，尋找和選擇最合適肝細(xì)胞來源,、生物反應(yīng)器和生物材料。生物反應(yīng)器和生物材料是“生物人工肝”的基本組成。在綜合考慮多種肝臟替代方法的優(yōu)缺點之后,，在治療肝臟疾病時,，我們可以進(jìn)行更有效的評估，可以發(fā)展出更有效的醫(yī)療技術(shù),。

關(guān)鍵詞：生物型人工肝,，肝細(xì)胞，生物材料,，肝功能不全

引言

肝功能障礙可以發(fā)生于多種病理狀態(tài)下,，會出現(xiàn)嚴(yán)重的代謝紊亂，嚴(yán)重時會出現(xiàn)“毒血癥”,。全球每年出現(xiàn)肝功能不全患者的數(shù)量達(dá)到約二百萬人,標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)科治療方法不令人滿意,，平均死亡率約為80%。肝移植是肝衰竭治療的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”,。每年, 在美國大約進(jìn)行6000例肝移植, 而在英國大約有600-700例,。然而,，肝移植的效果也受限于手術(shù)風(fēng)險,、術(shù)后并發(fā)癥、免疫抑制治療以及缺乏足夠的肝臟供體^【1】,。關(guān)于內(nèi)源性或外源性毒物清除的方法,，很多都是類似于血液透析、血漿置換,、血液吸附等體外血液凈化方式^【2】,，這些方法只替代了肝臟的解毒功能，而對于肝臟代謝過程并沒有影響,。而一般這些替代治療方法的治療效率并非遠(yuǎn)高于常規(guī)治療,。已知的治療方法均存在各種限制，同時缺乏有效性,，因此需要改進(jìn)及發(fā)展新的治療方式,，以替代肝臟進(jìn)行解毒以及正常的代謝。

在這種背景下,，出現(xiàn)了更多的關(guān)于肝臟替代的研究,，利用體外的“肝臟輔助”裝置，進(jìn)行解毒治療,同時改善代謝功能,。其中一種有前途的方法,，在體外裝置上利用肝臟細(xì)胞或細(xì)胞碎片，形成 “生物人工肝”設(shè)備,，進(jìn)行肝臟替代^【3,4】,。“人工肝”設(shè)備發(fā)展面臨的已知困難，包括進(jìn)一步明確肝臟內(nèi)復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，設(shè)備中復(fù)雜的肝細(xì)胞的提取,、培養(yǎng),、儲存技術(shù)，以及高昂的費用問題,。在綜合考慮多種肝臟替代方法的優(yōu)缺點之后,，在治療肝臟疾病時，可以進(jìn)行更有效的評估,，可以發(fā)展出更有效的肝臟替代技術(shù),。

1. 肝臟治療的傳統(tǒng)方法及“人工肝”

在肝功能衰竭的發(fā)展過程中，血氨,、芳香族氨基酸,、膽紅素、硫醇,、酚類化合物,、脂肪酸和一些其他物質(zhì)濃度增高，是重要的致病因素^【5,、6】,。有鑒于此，最初的“人工肝”如血漿置換,、血液透析,、血液吸附等治療的目的都是為了清除這些物質(zhì)。

1.1 血漿置換

    最初,，血漿置換用于治療疾病,，清除血液中的自身抗體以及免疫復(fù)合物，后來其臨床應(yīng)用范圍逐漸擴大,。Chang^【7】第一個成功的應(yīng)用血漿置換治療肝昏迷患者,。隨后相關(guān)研究明顯增加。研究顯示,，在急性肝衰竭患者,，血漿置換治療的臨床有效率在30-60%^【8、9】,，而生存率在20%左右,。在爆發(fā)性肝衰竭，血漿置換者的生存率在10%左右,。盡管血漿置換臨床應(yīng)用廣泛,，但其治療機制仍不完全清楚^【10】。用于標(biāo)志血漿的實驗室指標(biāo)仍難以確定,。甚至有研究發(fā)現(xiàn),，對急性肝衰竭進(jìn)行血漿置換治療,，利用血漿中提取出的人血白蛋白或異體血漿，反而不利于損傷肝臟的恢復(fù)^【11】,。

1.2 透析,、濾過和吸附

   有研究成功的應(yīng)用了血液透析治療慢性肝功能衰竭，因此人們希望把這種方法應(yīng)用于肝衰竭,。然而,，雖然能夠降低血氨，并且在透析液中檢測到血氨,，但臨床觀察到的首要結(jié)果仍不理想^【12】,。結(jié)果提示，血氨升高在肝昏迷的發(fā)病機制中占有比較重要的地位,，但也指出,，并非所有導(dǎo)致肝昏迷發(fā)病的物質(zhì)都可以通過透析清除。一些學(xué)者認(rèn)為,，這一結(jié)果是因為濾膜對中分子物質(zhì)的通透性不足所導(dǎo)致,。

更多的研究聚焦于新型材質(zhì)的聚丙烯腈透析膜，它對中分子物質(zhì)的通透性良好,。例如,，應(yīng)用RP-6, Opolon^【13】膜進(jìn)行血液透析時，對39例肝昏迷患者中的17位患者有效,，有一段時間 的意識復(fù)蘇伴血液中中分子物質(zhì)濃度的下降,。然而，77%的病死率并未顯示出與非血液透析組的差異,。使用這種方法的局限還包括各種并發(fā)癥：低血壓和血容量減少,心律不齊，酸中毒,、貧血,、電解質(zhì)失衡、凝血系統(tǒng)的變化,，以及肝素和機械對血細(xì)胞的影響^【2,14】,。

隨著分子量的增加，彌散通過半透膜的物質(zhì)會減少,。中分子量的物質(zhì)不容易利用濃度梯度差通過透析膜,，而增加濾過壓可以增加其清除?；谶@種想法,，人們進(jìn)行了血液濾過治療，這一方法通過增加濾過壓力而清除循環(huán)中的溶質(zhì),。當(dāng)血液濾過用于肝臟衰竭時,，患者的生存率為60%^【15】,。

在標(biāo)準(zhǔn)血液透析治療時，可以通過增加清除液體的量,，從而增加治療效率,，原因是由于對流和濾過量的增加。這一過程可以看做是透析和血液濾過的結(jié)合,。“血液透析濾過”利用特殊的透析器,，進(jìn)行高流量的超濾。在治療后,，盡管中分子量物質(zhì)清除增加,，部分臨床癥狀改善，但需要注意的是,，應(yīng)用高通量濾膜會導(dǎo)致一些重要生理物質(zhì)的丟失（如激素,、維生素、氨基酸等）,。這些物質(zhì)丟失的結(jié)果尚缺少臨床觀察^【16】,。

分子吸附再循環(huán)系統(tǒng)（MARS），利用透析方法治療肝衰竭,，其原理為“白蛋白透析”,。這種方法可以清除血液中的蛋白結(jié)合毒素及水溶性毒素^{【17、18】},。白蛋白透析液經(jīng)過活性炭及離子交換樹脂而“再生”,，這使得一定量的白蛋白在整個治療過程中反復(fù)應(yīng)用而不降低治療效率。根據(jù)病情的程度,，MARS可應(yīng)用3-5天,，每次治療2-6小時。MARS的應(yīng)用可以改善生命體征,，減輕神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,，但生存率無明顯增加^【19】。然而,，同其他濾過方法一樣,，MARS也會清除血液中的一些重要的細(xì)胞因子如IL-6，TNF等,，而這些細(xì)胞因子可能參與了肝細(xì)胞再生過程^【20】,。另外，需要注意的是,，MARS并不是一個獨立的設(shè)備,，它必須與其他血液透析設(shè)備聯(lián)合應(yīng)用。它的費用昂貴,，尤其是耗材（每套數(shù)千歐元）,，極大的限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用,。然而，白蛋白透析在目前的體外肝臟替代技術(shù)中,，仍處于領(lǐng)先地位,。

為了減少白蛋白透析的成本，俄羅斯自行研發(fā),，生產(chǎn)白蛋白及吸附劑^【21】,。

他們對15例因不同病因?qū)е碌母喂δ芩ソ叩牟∪诉M(jìn)行了一種生物型人工肝的治療^【22】，實驗發(fā)現(xiàn)這種方法治療效率高,，在所有患者,，細(xì)胞破壞及膽汁淤積的生物標(biāo)志物均明顯下降，而內(nèi)源性中毒征象也均好轉(zhuǎn),。在治療過程中,，沒有副反應(yīng)的報道，而病死率為6.7%,。這種命名為“普羅米修斯系統(tǒng)”的體外技術(shù),，同樣利用了吸附的原理，其吸附的是透過半透膜的血漿中的白蛋白,。臨床試驗發(fā)現(xiàn),，與MARS系統(tǒng)相比，這種方法具有更好地治療效果,，但對于血流動力學(xué)狀態(tài)并沒有更好的改善作用^【23】,。

關(guān)于血液吸附治療肝衰竭的初始研究，顯示了其可以降低中分子量,、疏水性分子及其他毒物的血液濃度^【24】,，病人生存率上升到65%^【25】。在病毒性乙型肝炎導(dǎo)致的肝衰竭中,，血液吸附可以短期（1-2天）降低總膽紅素和直接膽紅素,，但對整體臨床預(yù)后并沒有明顯改善^【26】。其作者的觀點認(rèn)為,，血液吸附對于肝衰竭治療無效，原因可能為吸附劑表面吸附了一些對于肝臟再生非常重要的肽類和代謝產(chǎn)物,。事實上,，在吸附治療后分析活性炭表面的化學(xué)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了茚三酮的存在,另外還有Lowry-positive化合物,、醛糖,、山梨糖、過氧化物,、有機酸和中等分子量的高生物活性的多肽等^【27】,。慢性肝衰竭病人進(jìn)行血液吸附治療的長期研究發(fā)現(xiàn),，血液吸附治療可以改善臨床癥狀，與治療前相比,，蛋白質(zhì)代謝,、肝酶活性以及中樞系統(tǒng)損害等情況都有所改善^【28】。血液灌流可以延長慢性肝病的臨床緩解期,，尤其對酒精性肝病的患者更為有效,。一般來說，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)分析表明,，血液吸附對于肝衰竭治療的積極作用,，是因為其清除了血液內(nèi)的某些氨基酸、酚類,、脂肪和膽汁酸以及膽紅素等物質(zhì),。選擇性的清除這些物質(zhì)肯定對疾病有利，但并不能解決肝衰竭治療的問題,。

因此,，盡管對臨床指標(biāo)有改善，但透析濾過的方法并不能增加病人的生存率^【29】,。這可能是因為血液吸附的副作用導(dǎo)致的,，包括血液體外循環(huán)期間補體激活、白細(xì)胞減少,、全身炎癥反應(yīng),、凝血功能障礙等。另外一點重要的不足之處,，在于這些方式清除了一些參與肝細(xì)胞再生的激素和生長因子^【20】,。這些體外肝臟替代技術(shù)都是替代了肝臟的清除功能，而對肝衰竭造成的其他功能缺失沒有治療作用,。在這種情況說明非生物型人工肝有著不可避免的不足,。如今，人們清晰的認(rèn)識到,，需要創(chuàng)造一種具有生理活性的肝臟輔助系統(tǒng),，同時具有肝臟的代謝和解毒功能^【30】。一種合理的解決方法,，是用不同的肝臟替代方法組合在一起,，來治療肝功能衰竭^【31】。

2. 設(shè)計和創(chuàng)造“生物型人工肝”

自上世紀(jì)80年代以來,，新的肝臟替代方法開始出現(xiàn),，并在近年來發(fā)展迅速。這種方法利用血液灌流的形式,，進(jìn)行生物治療,，在體外循環(huán)中利用培養(yǎng)出的細(xì)胞或組織片段,，來實現(xiàn)肝臟功能，代喪失了功能的肝臟,。這種方法所采用的設(shè)備被稱為“人工肝”或“生物型人工肝”,。它們把患者的血液或血漿通過含有代謝活性物質(zhì)的生物反應(yīng)器，實現(xiàn)對內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的解毒和生物轉(zhuǎn)化,，并合成蛋白子,、尿素、甘油三酯等,。

一種相對簡單的生物型人工肝,，是應(yīng)用豬的肝臟，其胞液中含有線粒體和微粒體,，用于肝衰竭時的解毒治療^【31】,。模型實驗和動物實驗證明了此種方法的效果，具有很強肝臟解毒作用,，減少了疾病的過程和強度,，使得血液各種生化指標(biāo)趨于正常。在臨床前研究中進(jìn)行的生化,、血液和免疫監(jiān)測中,，均證明了這種方法的安全性和有效性。

Seglen^【32】等人利用含有膠原酶和透明質(zhì)酸酶的溶液,，對完整的肝臟進(jìn)行處理,，從而中斷肝細(xì)胞之間的連接；Berry和Friend等^【33】,，利用結(jié)合酶和機械分離的方法,，來實現(xiàn)這一過程，實現(xiàn)肝細(xì)胞之間的分離,。這一成果是創(chuàng)造生物型人工肝中,，重要的一步。改善低溫存儲技術(shù),，使得肝細(xì)胞能夠低溫貯藏,，使得肝細(xì)胞在體外能夠存活更長時間，為生物型人工肝的臨床和實驗研究提供了可能性,。

當(dāng)前,，各種臨時性生物肝臟替代系統(tǒng)之間最重要的不同包括：細(xì)胞的來源（種類）；在肝細(xì)胞灌注時,，生物反應(yīng)器與血液或血漿接觸的環(huán)境；以及細(xì)胞固定在生物反應(yīng)器上的方法,。一些設(shè)備研發(fā)人員認(rèn)為,，應(yīng)該把這種生物技術(shù)與所有常規(guī)肝臟體外解毒治療方式相結(jié)合,，包括血液吸附、透析,、濾過和置換等,。

2.1 肝細(xì)胞的來源

    傳統(tǒng)的肝臟病學(xué)領(lǐng)域認(rèn)為，肝臟大部分切除后,，只要殘余肝臟體積在20%以上,，就可以維持正常的肝臟功能。這大約是200g,，2ⅹ10¹⁰個肝細(xì)胞,。然而，臨床研究顯示,，在體外生物型人工肝中應(yīng)用同等數(shù)量的肝細(xì)胞,，雖然可以改善生化指標(biāo)及臨床癥狀，但并不能改善總體生存率,。除了細(xì)胞數(shù)量,，一些其他因素如肝細(xì)胞的活性及功能也會影響治療效果。

2.1.1    原代人類肝細(xì)胞

     理論上,，對于體外生物型人工肝設(shè)備,，原代人類肝細(xì)胞是最理想的選擇，因為其安全性和生物活性均滿足治療需求,。在體外人工肝設(shè)備比較原代人類肝細(xì)胞,、人類胎兒肝細(xì)胞及豬肝細(xì)胞代謝的情況，結(jié)果顯示,，與豬肝細(xì)胞相比較,，原代人類肝細(xì)胞對于血氨的清除能力和尿素氮的合成能力，分別是豬肝細(xì)胞的2倍和3倍^【34】,。同時,在人類胎兒肝細(xì)胞,，利多卡因的新陳代謝比豬的肝細(xì)胞高3.5倍。體外人工肝設(shè)備使用人類原代肝細(xì)胞的缺點,，包括增殖能力不強,，生存期短（1-2周）。在大多數(shù)情況下,人類原代肝細(xì)胞的獲得,，是在肝硬化,、肝纖維化、膽管炎等情況所手術(shù)切除的肝臟,，所以肝細(xì)胞的數(shù)量和功能往往是不足的,并且細(xì)菌和病毒感染的風(fēng)險很高,。

盡管肝臟具有再生的能力，但在體外進(jìn)行肝細(xì)胞的培養(yǎng)是非常困難的。即使在最佳的培養(yǎng)基中,，原代人類肝細(xì)胞在數(shù)小時內(nèi)也會出現(xiàn)“去分化”,，失去其特異的基因表達(dá)及相應(yīng)的功能。有一種方法是建立“原代人類肝細(xì)胞”庫,，以儲存人類肝細(xì)胞并嚴(yán)格控制其質(zhì)量,，已備“體外生物型人工肝”使用。

2.1.2   人類肝細(xì)胞系

目前,，唯一批準(zhǔn)在臨床體外人工肝設(shè)備上使用的人類肝細(xì)胞系是C3A肝細(xì)胞,，它是通過克隆HepG2 細(xì)胞系獲得的。然而,，與原代豬肝細(xì)胞相比,，C3A肝細(xì)胞在解毒和代謝能力均較弱，而這對于肝衰竭的病人恰恰是最重要的^{【36,、37】},。因此在臨床體外人工肝系統(tǒng)使用C3A肝細(xì)胞可能并不合理。

人們采用各種方法來制備功能強,、“不滅”的肝細(xì)胞系,。Dolgikh^【38】在綜述中提到，傳統(tǒng)方法制備“不滅”肝細(xì)胞包括逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤抗原SV-40,，它的產(chǎn)生與調(diào)節(jié)蛋白Rb及P53有關(guān),。也可以采用肝癌細(xì)胞在特定培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。然而,，需要指出的是,，“不滅”的肝細(xì)胞的功能可能是不完全的，并可能存在一些基因方面的風(fēng)險,。目前,，更多的研究聚焦于從胚胎中獲取或從多功能干細(xì)胞中培養(yǎng)，從而獲得“不滅”的人類肝細(xì)胞^【30】,。

2.1.3    原代豬肝細(xì)胞

在體外生物人工肝系統(tǒng)中,，原代豬肝細(xì)胞應(yīng)用的比較廣泛，這是由于其提取及培養(yǎng)技術(shù)成熟,，肝源容易獲得且成本低,。然而,這里仍然存在一些問題,主要是相關(guān)豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的潛在風(fēng)險。一些研究表明, 豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒可以感染人類肝細(xì)胞和其他體外培養(yǎng)的細(xì)胞^【39,、40】,。由于這種風(fēng)險的存在，歐洲的一些國家禁止使用原代豬肝細(xì)胞,，限制了其在體外生物人工肝系統(tǒng)中的應(yīng)用^【41】,。

其他關(guān)于肝臟支持系統(tǒng)Hepat Assist的研究^【42】，沒有發(fā)現(xiàn)豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳染。28例患者應(yīng)用這種設(shè)備治療了5年,，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)檢測外周血單核細(xì)胞,，并沒有發(fā)現(xiàn)豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染。體外研究也表明,，細(xì)胞膜的存在減少了豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的風(fēng)險。將豬的肝細(xì)胞和人的細(xì)胞共同進(jìn)行培養(yǎng),，并未發(fā)現(xiàn)病毒的繁殖,。這些結(jié)果認(rèn)為，生物型人工肝系統(tǒng)中應(yīng)用豬肝細(xì)胞會導(dǎo)致病毒感染這一說法是不正確的,。

根據(jù)美國食品藥品管理局的要求,，來源于某些特定品種豬的肝細(xì)胞，在適當(dāng)保存的情況下,，可以應(yīng)用于人工肝設(shè)備【43】,。這主要是因為，在病人血液流經(jīng)進(jìn)行異種肝細(xì)胞灌注時,，有發(fā)生免疫反應(yīng)的風(fēng)險,。另一個重要的 問題，是在灌流治療時期,，保護豬的肝細(xì)胞避免被人血中的免疫球蛋白所破壞,。解決這一問題的途徑，是通過控制濾膜的截留分子量,，使得分子量在100 kDa左右的物質(zhì),，可以通過濾膜，如白蛋白(60 - 80 kDa)等,，但人免疫球蛋白(2500 kDa)則保留在膜的另一端,，避免進(jìn)行肝細(xì)胞灌流。

2.1.4    肝細(xì)胞與非實質(zhì)細(xì)胞的共同培養(yǎng)

      對于人體的很多器官和系統(tǒng)來說,，細(xì)胞和細(xì)胞之間的相互作用都是非常重要的,。實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞的相互作用，決定了細(xì)胞的增長,、遷移和分化,。這一點在生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)方面都非常重要,，可以據(jù)此制定新的方法來治療疾病,。

不同細(xì)胞間的相互作用在肝臟功能的形成中起到重要作用。肝臟是由復(fù)雜的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成的,，由內(nèi)皮細(xì)胞分隔成Disse小體,。肝臟結(jié)構(gòu)還包含脂肪細(xì)胞(星狀細(xì)胞或Ito細(xì)胞)，膽管細(xì)胞和枯否細(xì)胞。因此,成熟的肝臟就是一個很多復(fù)雜的細(xì)胞相互作用的載體,，讓各種細(xì)胞有效和協(xié)調(diào)的進(jìn)行各種功能,。

研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞與其它多種細(xì)胞共同進(jìn)行培養(yǎng),，可以在體外穩(wěn)定存活幾個星期并保持其功能活性,。共同培養(yǎng)的結(jié)果可以廣泛應(yīng)用于各種研究，包括生理及病理生理過程,，包括氧化應(yīng)激反應(yīng),，包括外源性物質(zhì)的毒性作用等等^【45】。成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞共同培養(yǎng),，由于細(xì)胞間相互作用,，表現(xiàn)為在肝細(xì)胞形成的“島”周圍環(huán)繞著成纖維細(xì)胞^【46】。在這種情況下長時間保存的肝細(xì)胞的功能,，包括在65天時還可以分泌白蛋白,。這項成果給 的研究帶來啟示：在體外生物人工肝系統(tǒng)的生物反應(yīng)器中，通過共同培養(yǎng)的肝細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞,，模擬生理肝臟組織^{【47,、48】}。小鼠的肝細(xì)胞及成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)所形成的細(xì)胞系(NIH3T3),，具有分泌水溶性因子的能力,，如轉(zhuǎn)化生長因子，可以刺激肝臟功能,。另一項研究發(fā)現(xiàn),，肝細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞共同組成的細(xì)胞層，可以表達(dá)藥物代謝的基因,，并維持肝細(xì)胞在一個高水平的代謝活性^【49】,。在共同培養(yǎng)系統(tǒng)中，肝細(xì)胞的功能活性以及部分基因表達(dá)這兩點,，起著非常重要的作用^【50】,。而后續(xù)的研究也證實了這一點^【51】。

隨后,，又有很多研究針對實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞的共同培養(yǎng),，來選擇一種最佳的培養(yǎng)方法，但是,，發(fā)現(xiàn)其中存在很多問題難以解決,。

2.1.5    由干細(xì)胞而來的肝細(xì)胞

人胚胎干細(xì)胞可以分化成肝臟細(xì)胞^【52,53】。這個過程即可以通過胚胎體形成過程時的自主分化,，也可以通過直接分化而完成,。干細(xì)胞自主分化可以形成胚胎體,，包含著大量各種不同細(xì)胞，形成胚芽層^【54】,。胚胎體可以自主分化出肝臟細(xì)胞,，但效率不高。直接分化可以不用形成胚胎體,，更加更快速有效的產(chǎn)生肝臟細(xì)胞^【55,56】,。在一項研究中，在生物反應(yīng)器中合適的膜（孔徑0.2微米）上,，通過胚胎體的多部分化和細(xì)胞培養(yǎng),，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞從而獲得肝細(xì)胞樣的細(xì)胞^【57】。在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的最后一步,，細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，兩組核仁和大量細(xì)胞漿小體的改變,，導(dǎo)致細(xì)胞變成多邊形,。研究中通過電鏡發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞表面具有糖原,、小管系統(tǒng)和微膽管等結(jié)構(gòu),。PCR研究發(fā)現(xiàn)，白蛋白mRNA表達(dá)增加,，白蛋白的產(chǎn)生及尿素氮的產(chǎn)生都隨之增加,。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞群附著在生物反應(yīng)器的中空纖維上,。在未來,，胚胎干細(xì)胞似乎可以成為用之不盡的肝細(xì)胞的來源，然而,，同軀體細(xì)胞一樣,，它們的功能取決于周圍的組織環(huán)境或者說“合適的位置”。

2.2    肝細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)

    “合適的位置”的關(guān)鍵內(nèi)容包括各種生長因子,，細(xì)胞間的連接方式以及周圍的細(xì)胞基質(zhì),，它們可以調(diào)節(jié)組織的形成、恢復(fù)肝細(xì)胞的功能^【58】,。細(xì)胞外基質(zhì)的變化,，可以影響誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化，維持肝臟細(xì)胞的表型^【49】,。細(xì)胞在三維空間分布的位置以及它們的生化和局部解剖特點,，顯著影響了其分化及增殖過程。與三維結(jié)構(gòu)相比較,，把體外肝臟替代裝置設(shè)計成二維結(jié)構(gòu),，與生理肝臟功能不符合,。研究【59】顯示，在一個旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器中,，由HepG2細(xì)胞形成的三維結(jié)構(gòu)球狀體的細(xì)胞色素P450酶活性高,，生成白蛋白能力強。然而,，把此球狀體轉(zhuǎn)移到二維結(jié)構(gòu)平板培養(yǎng)基上后,，上述功能消失，球狀體結(jié)構(gòu)瓦解,。研究說明了三維結(jié)構(gòu)培養(yǎng)肝臟細(xì)胞的優(yōu)點,，單層細(xì)胞培養(yǎng)時，由于細(xì)胞內(nèi)吞作用,，表現(xiàn)為細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的明顯變化,，隨之細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞器移位,，細(xì)胞功能不完整^【60】,。而同時，典型的高精度的三維結(jié)構(gòu)培養(yǎng)的肝細(xì)胞^【61】,，可以細(xì)胞骨架位置固定,，細(xì)胞器位置固定,，細(xì)胞功能較好,。

在生物反應(yīng)器中使用聚酰胺和聚酯中空纖維 ^【62】,，可以使細(xì)胞分布均勻，把肝細(xì)胞固化在纖維管表面,，通過含氧膜的纖維管網(wǎng),，形成三維結(jié)構(gòu)。在這樣的系統(tǒng)中,，把含5%二氧化碳的介質(zhì)泵入纖維管中,，細(xì)胞被固定在中空纖維膜的表面。細(xì)胞在纖維管的外表面粘附和生長,，達(dá)到類似組織的細(xì)胞密度,。這種細(xì)胞在培養(yǎng)基中密集生長的方式類似于其在體內(nèi)的過程。Powers等人創(chuàng)造了個生物反應(yīng)器,，以三維結(jié)構(gòu)培養(yǎng)肝細(xì)胞,，刺激其組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化形成類似膽管的結(jié)構(gòu)^【63】。應(yīng)用三維模式系統(tǒng),，有望幫助我們了解細(xì)胞功能,，細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用，以及大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞系統(tǒng)來測試藥物或進(jìn)行體外生物人工肝系統(tǒng),。

2.3    “生物型人工肝”的生物材料

     構(gòu)成三維細(xì)胞模型需要的三維結(jié)構(gòu),，是由海綿,、凝膠的大量材料組成的復(fù)雜的系統(tǒng)。凝膠樣物質(zhì)形成的結(jié)構(gòu)需要一些特定工藝,，以使得細(xì)胞得以在其上生長,。凝膠形成過程應(yīng)該控制其工藝參數(shù),以確保其完整性和強度、生物相容性,，需要能夠粘附特定細(xì)胞,，另外還要考慮生物降解速率以及彌散特性。細(xì)胞在凝膠內(nèi)部附著生長,，后者應(yīng)該促進(jìn)細(xì)胞遷移到三維矩陣內(nèi),促進(jìn)細(xì)胞隨后的附件,分裂和分化,。水凝膠，由天然蛋白質(zhì)(如膠原蛋白)構(gòu)成,，具有以上特點,。一些天然的和人工合成的生物可降解材料被用于生物工程組織，包括肝臟,。這樣的材料由有機聚合物組成,，具有一些物理和生物化學(xué)特性，并且可以被生物降解,。細(xì)胞外基質(zhì)的自然結(jié)構(gòu)被修改后，可以被廣泛應(yīng)用作為肝臟生物工程的支架,，因為它們具有必要的結(jié)構(gòu),，并可以提供必要的生物活性物質(zhì)。它不僅作為細(xì)胞附著和擴張的位點,，同時還可以刺激細(xì)胞的生長和分化,。多種細(xì)胞外基質(zhì)的組分被用于作為肝臟生物工程的支架，尤其是膠原蛋白,。一些研究者提出^{【64,，65】}，在三維結(jié)構(gòu)的膠原蛋白上進(jìn)行肝細(xì)胞的培養(yǎng),，在肝細(xì)胞形成過程中,，可以有外源性生長因子及激素的表達(dá)以及白蛋白的合成。

在很多研究中^【66-68】,，都證實了使用膠原蛋白培養(yǎng)肝細(xì)胞的可能性,。研究顯示，膠原蛋白和肝細(xì)胞之間的相互作用機制非常復(fù)雜,。將肝細(xì)胞注射到膠原蛋白中,，膠原蛋白收縮，對于低分子物質(zhì)的彌散作用改變,。肝細(xì)胞的數(shù)量及繁殖能力決定了膠原蛋白收縮的程度^【69】,。

透明質(zhì)酸是另外一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分,，它參與調(diào)解細(xì)胞的擴張和分裂；它在細(xì)胞的信息傳導(dǎo)和移動過程中,，起著重要的作用,。在人類胎兒肝母細(xì)胞和肝臟細(xì)胞表面，表達(dá)了一種透明質(zhì)酸受體,，稱作CD44,。受體的作用，允許透明質(zhì)酸和其他化學(xué)物質(zhì)形成水凝膠,，使得肝母細(xì)胞和肝臟細(xì)胞具有良好的粘合能力,；這樣的系統(tǒng)可以在4周之內(nèi)保持功能和能力的完整【70】。

當(dāng)前,，大多數(shù)人的注意力關(guān)注在天然水凝膠材料,，例如基底膜基質(zhì)或藻酸鹽，用于三維結(jié)構(gòu)肝細(xì)胞培養(yǎng)【71】,。基底膜基質(zhì)含有可溶性的復(fù)合蛋白膜,，一般從小鼠軟骨肉瘤，層粘連蛋白,，膠原IV,，肝素等中提取【72】。在基底膜基質(zhì)中培養(yǎng)肝細(xì)胞,，可以形成多細(xì)胞球狀體集群,，但是它們的多邊形結(jié)構(gòu)不如體內(nèi)的肝細(xì)胞【73】。人工基底膜是一種包含許多天然生物分子的特殊生物材料,，其異構(gòu)性質(zhì)和不明分子成分,，使得在實驗內(nèi)難以控制其程度。此外,，它是腫瘤組織來源的,，限制了其臨床細(xì)胞療法或組織工程的應(yīng)用。

海藻酸是一種天然多糖,，來自海洋藻類,。在各種二價陽離子(鈣、鎂)存在時,，以離子交聯(lián)羧化物組橋形成聚合物骨干,，形成海藻酸凝膠。海藻酸水凝膠可以通過多種機制形成,，包括物理和化學(xué)凝膠,，它可用于創(chuàng)建特殊的微球結(jié)構(gòu)，作為后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的材料,。例如注射人類胎兒肝母細(xì)胞到含有藻酸鹽的膠囊中,，會改善這些細(xì)胞的生長特性,，隨后分化為成熟肝細(xì)胞【74】。同時,還具有清除血氨,，合成白蛋白,、細(xì)胞色素P450，形成膽汁及毛細(xì)血管的能力,。

人類胚體在海藻酸中培養(yǎng),，可以表達(dá)外源性生長因子，分化出可以表達(dá)前白蛋白,、白蛋白,、CYP7A1和細(xì)胞角蛋白18的肝細(xì)胞^【75】，而在海藻酸中培養(yǎng)C3A系肝細(xì)胞,，形成多細(xì)胞球狀體,，具有更明顯的細(xì)胞色素P450活性表達(dá)^【76】。

科學(xué)家發(fā)明了一種“生物型人工肝”設(shè)備,，使用來自人體的肝臟HepG2細(xì)胞^【77】,，封裝在藻酸鹽中，使用JetCutter裝置生產(chǎn)大約500μm球形珠狀體,，內(nèi)含細(xì)胞175萬/毫升,；它們在生物反應(yīng)器上擴散形成緊湊的、細(xì)胞-細(xì)胞間有良好關(guān)系的球狀體,。培養(yǎng)11 - 13天后,，細(xì)胞數(shù)34倍增加，細(xì)胞密度增加,，發(fā)現(xiàn)球狀體。提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)以優(yōu)化細(xì)胞,，可以增加細(xì)胞密度高達(dá)4500萬/毫升海藻酸,，粒子中細(xì)胞5×10 ¹⁰/毫升。這個過程的時間是可調(diào)整的,，適用于臨床實踐,。作者還開發(fā)了一個短期適宜溫度細(xì)胞儲存器，使運輸?shù)募?xì)胞材料可以保存48小時,，適合用于制造生物型人工肝,。

自然生物材料的各種化學(xué)及生物化學(xué)組分是用于生物反應(yīng)器和生物型人工肝，但倫理學(xué)問題和安全性阻礙了其使用,。

2.4    用于“生物型人工肝”的聚合物材料

    與天然材料相比,，合成生物聚合物有一定的優(yōu)勢，因為他們有一個相對優(yōu)勢,，即可能不會引起排斥反應(yīng),，可以適應(yīng)各種技術(shù)特點,。例如，研究表明,，在進(jìn)行豬胚胎肝細(xì)胞的三維培養(yǎng)時,，聚乳酸生物反應(yīng)器能夠改善細(xì)胞功能^【78】。在幾項研究中^【79,80】,，已經(jīng)證明聚氨酯泡沫可能有助于鼠肝細(xì)胞形成球形的多細(xì)胞結(jié)構(gòu),，當(dāng)添加各種生長因子的老鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，形成球狀體,，肝臟表達(dá)包括原始胚胎白蛋白和色氨酸2,3-加雙氧酶^【81】,。然而，這些聚合物的降解特點,，表面侵蝕和疏水性等限制了它們的使用^【82】,。聚合物的降解產(chǎn)物積累可能導(dǎo)致衍生物和誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。盡管如此,，可以通過利用蛋白質(zhì)修改結(jié)構(gòu),，利用光化學(xué)效果和建立生物活性支架減少上述限制，促進(jìn)細(xì)胞粘附,、遷移,、生長和組織修復(fù)的過程^【83】。

3    “生物型人工肝”生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)的特點

    ”生物型人工肝“ 的治療特點決定了其生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu),，由生存長期和有效的肝細(xì)胞以及其他細(xì)胞材料,，以懸浮液的形式結(jié)合在2 維和3 維生物工程結(jié)構(gòu)上。為了實現(xiàn)這一目標(biāo),，需要選擇和開發(fā)適當(dāng)?shù)脑O(shè)備,。理想的系統(tǒng)應(yīng)該在長時間的灌注治療中，模仿體內(nèi)微環(huán)境,，促進(jìn)細(xì)胞和培養(yǎng)基的穩(wěn)定,。合成的空心纖維生物反應(yīng)器尤其適合這一目的。

3.1   基于中空纖維的生物反應(yīng)器

    這類生物反應(yīng)器通常用于 “生物型人工肝”設(shè)備,；在這種情況下細(xì)胞通常是固定在膜之間的空間,，血液或血漿流經(jīng)纖維管。治療的原則是基于情況,，增加血液中某些有毒物質(zhì)穿過半透膜的濃度,，然后進(jìn)行肝細(xì)胞的解毒。生物反應(yīng)器的類型主要由肝細(xì)胞連接方式所決定,。例如,在蘭德(體外肝臟輔助設(shè)備)設(shè)備,人類C3A肝細(xì)胞是位于纖維空間外側(cè)^【36】,。BLSS(生物人工肝支持系統(tǒng))設(shè)備使用豬的肝細(xì)胞懸浮在膠原凝膠中^【84】；HepatAssist 2000設(shè)備^【85】采用右旋糖酐固定豬的肝細(xì)胞微粒，而學(xué)術(shù)醫(yī)療中心的設(shè)備使用聚酯基 ^【86】,。2001年,所謂的MELS (模塊化體外肝支持)應(yīng)用具有三個隔間的中空纖維膜組成的復(fù)雜的筒結(jié)構(gòu),，提供肝細(xì)胞、氧氣和營養(yǎng)^【87】,。肝細(xì)胞在膠原基質(zhì)培養(yǎng)的的膜內(nèi)空間,。該系統(tǒng)還允許共同培養(yǎng)不同的非實質(zhì)細(xì)胞，與肝細(xì)胞共同形成組織結(jié)構(gòu)和毛細(xì)膽管,。

在中國,，幾個版本的中空纖維型“生物型人工肝”已經(jīng)在臨床進(jìn)行使用，包括吸附和血漿置換模式: HALSS (混合人工肝支持系統(tǒng))在北京部隊事醫(yī)院^【88】,；HEBAL(混合型生物人工肝)南京大學(xué)^【89】,；NEBAL(生物人工肝)浙江大學(xué)^【90】；BALSS (生物人工肝支持系統(tǒng))在南方醫(yī)科大學(xué)^【91】,。其他版本的生物反應(yīng)器均處于臨床前和/或臨床試驗階段,，包括LIVER-X 2000系統(tǒng)(美國明尼蘇達(dá)大學(xué)),血液經(jīng)中空纖維，在膜外空間進(jìn)行肝細(xì)胞灌注^【92】,。另一種方法在體外采用豬的肝臟細(xì)胞溶質(zhì),，解毒的方法接是在血液通過空心合成半透膜^【93】和中空纖維膜上的含氧生物反應(yīng)器^【94】(OXY-HFB)時，肝細(xì)胞和血液直接接觸發(fā)生反應(yīng)(德國圖賓根大學(xué)埃伯哈德卡爾),。

“生物型人工肝”設(shè)備中纖維管膜的發(fā)展過程,，是基于對治療需要的優(yōu)化過程。實現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵條件包括膜孔隙的大小,、最大直徑的限制,，孔徑的分布密度和均勻性高，膜的厚度,，纖維直徑和厚度的最優(yōu)比例,，疏水的表面特征。所有纖維需要耐受一定的液壓,，并具有彌散特征,，這些決定了選擇性物質(zhì)的清除情況。

3.2    Packed Bed系統(tǒng)

    “packed bed system”一詞最初是用于描述化學(xué)系統(tǒng),，空心管或其他容器充滿了包裝材料(顆粒的催化劑、吸附劑等),，兩者之間交互反應(yīng),。在人工肝設(shè)備，則意味著某些矩陣的充滿了灌注肝細(xì)胞和培養(yǎng)基或血液/血漿,。在多孔載體(基質(zhì)),，肝細(xì)胞可以在里面附著，防止壓力導(dǎo)致其損傷，在培養(yǎng)時允許較大的動作,。具體材料包括聚氨酯泡沫^【95】,，聚乙烯樹脂^【96】，海藻酸粒子^【97】,多孔羥基磷灰石^【98】,，和聚酯支架^【99】,。

使用固相的生物反應(yīng)器可以最大程度的避免氣泡壓力導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。在軸流過程中,，基質(zhì)的長度是一個關(guān)鍵參數(shù),，因為培養(yǎng)基供應(yīng)氧氣和營養(yǎng)有可能是不夠的。應(yīng)用大容量反應(yīng)器,，可以避免這個問題,。血流中富含的新陳代謝的產(chǎn)物可以被連續(xù)或間歇地清除。

3.3    密封系統(tǒng)的生物反應(yīng)器

    生物反應(yīng)器包含密封的的肝細(xì)胞,，細(xì)胞在聚合物基質(zhì)中形成小膠囊,，放置在特殊的灌注室中。海藻酸,，包括水凝膠^{【100-102】}等各種材料和一些合成聚合物可以用于封裝肝細(xì)胞,。到目前為止，沒有在臨床實踐中使用這樣的系統(tǒng),。

3.4    平板系統(tǒng)的生物反應(yīng)器

    通常,，基于平板的生物反應(yīng)器系統(tǒng)采用單層培養(yǎng)肝細(xì)胞，其基質(zhì)層應(yīng)用膠原蛋白,、層粘連蛋白,、纖連蛋白、人工基底膜組成“三明治”結(jié)構(gòu),，可以維持肝細(xì)胞的功能活動數(shù)周時間^【103】,。

    全平面膜示生物反應(yīng)器(FMB)^【104】包含50個并聯(lián)的操作模塊，每個模塊的表面積是1150厘米²,。每個模塊內(nèi)含2×10 ^8個細(xì)胞,，而整個生物反應(yīng)器可以容納1×10 ¹⁰個細(xì)胞。進(jìn)一步發(fā)展^【105】這個設(shè)備可以形成一種“三明治”模式,，即肝細(xì)胞被夾在兩層膠原蛋白之間,。與目前生物反應(yīng)器只能提供2維培養(yǎng)及有限的氧氣及營養(yǎng)的情況相比，這種生物反應(yīng)器效果大大增強,。這種基于“三明治”的培養(yǎng)被認(rèn)為是最好的體外肝細(xì)胞培養(yǎng)方式,，但如應(yīng)用于臨床則必須滿足一些問題：其中包括組裝大量模塊需要的大量工作，和需要供給更多數(shù)量的肝細(xì)胞,。

3.5    基于微流控分析芯片的生物反應(yīng)器

    微流體涉及物理,、化學(xué),、生物技術(shù)等多學(xué)科。這一領(lǐng)域的研究始于上世紀(jì)80年代,，用于噴墨打印機的創(chuàng)建,，DNA芯片，在微型電機和微型熱機技術(shù)更精確的控制,。目前,，微流控技術(shù)用于研究細(xì)胞的能動性和控制他們的相互作用^【106】。

使用這些技術(shù)(基于微觀流體芯片的系統(tǒng))已成為一個有前途的方向,，為“生物型人工肝”創(chuàng)造生物反應(yīng)器實現(xiàn)精確控制,。肝細(xì)胞的微環(huán)境有利于其功能活動的維護和優(yōu)化。例如,，人工創(chuàng)建了肝臟微流控內(nèi)皮屏障,，在其中培養(yǎng)的肝細(xì)胞維持他們的生存能力和代謝活動可達(dá)7天^【107】。而其他生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)中使用了聚二甲硅氧烷微型板塊以間隔肝細(xì)胞培養(yǎng)基及供養(yǎng)^【108】,。使用這樣一個生物反應(yīng)器可以達(dá)到高細(xì)胞密度(30 - 40百萬細(xì)胞/毫升)和有效溶質(zhì)移動,。

根據(jù)研究目的和目標(biāo)，生物反應(yīng)器細(xì)胞材料有不同的特點(溫度控制器,，泵速,，氧流速，pH值等),。各項參數(shù)均需要處于一定范圍,，以培養(yǎng)和維護細(xì)胞。另外,，生物反應(yīng)器的目標(biāo),，除了實現(xiàn)其基本功能，還特別要注意其對病人安全的影響,，在“生物型人工肝”中,，可以通過一個復(fù)雜的生物技術(shù)來解決這一問題。

4    “生物型人工肝”設(shè)備有效性的臨床研究

   臨床經(jīng)驗告訴我們,，“生物型人工肝”設(shè)備的使用不僅帶來益處,，同時存在一些問題，需要評估及發(fā)現(xiàn)這些技術(shù)的缺點,。

1986年,，出現(xiàn)了第一個體外灌注系統(tǒng)，以臨時替代部分肝臟(“輔助肝”),。作者的觀點,，分離出的血漿通過獨立的肝細(xì)胞，提供連續(xù)的解毒作用^【109】,。應(yīng)用這種方法治療急性和慢性肝衰竭昏迷病人，可以促進(jìn)意識恢復(fù)，降低轉(zhuǎn)氨酶活性,，改善整體健康,。然而，由于缺乏足夠的監(jiān)測,，以及進(jìn)一步研究,，很難得出其較基礎(chǔ)治療的有效性結(jié)論。這些技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,，出現(xiàn)了各種肝臟替代技術(shù)及系統(tǒng),，體外治療肝衰竭。

4.1   肝臟輔助設(shè)備

在臨床試驗中,，HepatAssist設(shè)備(現(xiàn)在更名為“HepaMate”)是目前研究最透徹的,。它使用了(5 - 7)×10 ⁹低溫貯藏原代豬肝細(xì)胞，附著在中空纖維的膜外空間,。它的生物反應(yīng)器是在1995年^【110】研發(fā)的,，由中空纖維附帶豬肝細(xì)胞微載體。微載體和細(xì)胞被放置在反應(yīng)器的膜外空間,，通過血漿進(jìn)行灌注,。在病人下腔靜脈置入雙腔導(dǎo)管，進(jìn)行血漿分離,，血漿通過一個包含50億個肝細(xì)胞的反應(yīng)器,，治療時間6-7小時。對9例肝衰竭患者進(jìn)行一次或多次治療,，8例患者(88%)恢復(fù),，其中7人隨后接受肝臟移植手術(shù)。一般來說,，所有患者能耐受操作,，治療可以降低顱內(nèi)壓，改善腦循環(huán),，降低血尿素和血氨的濃度,，改善神經(jīng)癥狀。在另一個隨機的臨床研究中,，全部39例患者中,，有32例成功地進(jìn)行肝移植；在6例急性肝衰竭患者,，治療后均顯著改,，月存活率為90%^【111】。在一項控制型臨床試驗^【112】中,，13例三期或四期肝性腦病患者,，接受9-110小時的人工肝治療,，有10例成功接受了肝臟移植。其中兩例病人肝功能自主恢復(fù),，一例病人肝臟替代前就進(jìn)行了肝移植,。盡管存在一些并發(fā)癥，如血流動力學(xué)不穩(wěn)定和出血,，但肝臟功能和生化參數(shù)有顯著改善,，總年存活率是80%。由此產(chǎn)生的積極作用促進(jìn)進(jìn)一步的隨機,、多中心,、對照試驗，研究對象是171例暴發(fā)性肝衰竭患者和肝移植術(shù)后并發(fā)癥患者^【113】,。在這項研究中,，86例患者接受標(biāo)準(zhǔn)治療，85名患者接受HepatAssist設(shè)備肝臟替代,。結(jié)果表明,，人工肝的使用降低了膽紅素濃度，但30天生存率較對照組無影響,。作者認(rèn)為,，不同病因和暴發(fā)性肝衰竭的嚴(yán)重程度，樣本量不足,，對于設(shè)備治療機制認(rèn)識不足等原因,，影響了試驗的結(jié)果。目前,，一項包括超過200名患者的大型臨床試驗在美國 (11個中心)和歐洲(9中心)正在進(jìn)行,，采用HepaLife技術(shù)，使用“HepaMate TM”設(shè)備和豬PICM-19肝細(xì)胞細(xì)胞系,。

4.2   體外肝臟輔助設(shè)備（ELAD）

    這個設(shè)備最初使用約200 g的人類肝癌細(xì)胞株C3A作為細(xì)胞的來源,，置于透析器中^【114】。大量臨床研究,，包括控制性試驗^【115】顯示,，與對照組相比，急性肝衰竭患者的許多臨床和實驗室參數(shù)以及生存率均明顯好轉(zhuǎn),。為了增加治療效率,，修改設(shè)備：半透膜的孔隙大小從70 kDa增加到120 kDa，灌注率從150 - 200毫升/分鐘提高到500毫升/分鐘,，細(xì)胞數(shù)量增加到400克,。修改后的設(shè)備還包含控制器內(nèi)的持續(xù)動態(tài)氧濃度監(jiān)測和反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖的生物消耗。在體外循環(huán)系統(tǒng),，還添加了額外的過濾器,，以防止細(xì)胞脫落^【36】,。然而，盡管如此,，但治療效率沒有顯著改善,。目前，中國和美國還在進(jìn)行相關(guān)臨床研究,。

4.3   AMC生物型人工肝設(shè)備（AMC-BAL）

    AMC-BAL設(shè)備由荷蘭阿姆斯特丹醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)中心設(shè)計，采用親水聚酯矩陣的生物反應(yīng)器,，4毫米的厚度和總表面積5610厘米²的中空纖維模^【116】,，內(nèi)含豬原代肝細(xì)胞數(shù)量約10¹⁰個。第一階段臨床試驗^【117】對7名急性肝衰竭患者進(jìn)行治療,，顯示積極的治療效果,，恢復(fù)肝臟功能。另一項研究12名等待肝移植的患者進(jìn)行治療,，結(jié)果顯示病人的神經(jīng)狀態(tài)和血液動力學(xué)得到改善^【86】,。

在一項12名患者的研究中，11名患者接受治療直到肝移植成功,，一例患者治療后癥狀改善,，不需要進(jìn)行肝移植治療。治療持續(xù)時間從4h到35 h不等,。30個月總體存活率為66%(8例),。然而，由于歐洲國家一些不批準(zhǔn)異種移植,，這些研究已經(jīng)結(jié)束,。研究人員目前正在對一些工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化：生物反應(yīng)器氧合，液體灌注的速度,，獲取和培養(yǎng)人肝細(xì)胞的方法等^【118】,。

4.4   BLSS設(shè)備（生物型人工肝系統(tǒng)）

     美國匹茲堡大學(xué)開發(fā)研究的BLSS系統(tǒng)，使用了中空纖維膜生物反應(yīng)器(100 kDa)和豬的肝細(xì)胞(從70g到100 g),、混合膠原凝膠^【119】,。有限的臨床研究對5例急性肝衰竭患者表現(xiàn)出足夠的療效，治療可以改善生化指標(biāo)和臨床癥狀,，無嚴(yán)重的并發(fā)癥出現(xiàn)^【120】,。當(dāng)時治療過程中，無患者發(fā)生豬戀物癖逆轉(zhuǎn)錄病毒感染,。

4.5   MELS設(shè)備（模塊化體外人工肝）

      MELS系統(tǒng)由德國柏林的Virchow診所研發(fā),，包含一個生物反應(yīng)器(CellModule)，以及豬或人類肝細(xì)胞解毒單元(DetoxModule),，進(jìn)行白蛋白透析,，透析單元(DialysisModule)進(jìn)行長時間的血液透析濾過^{【87,、121、122】},。肝細(xì)胞(重量500 - 600 g)被安置在三維矩陣中,，反應(yīng)器內(nèi)含有由兩組親水材料纖維，進(jìn)行血漿的交換,，還含有一組疏水性纖維,，以進(jìn)行氧氣和二氧化碳交換。第一階段的臨床試驗包括8例各種病因的急性肝衰竭患者,，其治療都是成功的,，沒有明顯并發(fā)癥表現(xiàn)，3年生存率為100%,。在這些患者中,，發(fā)現(xiàn)有發(fā)生戀物癖感染。其他相關(guān)臨床試驗,，應(yīng)用原代人類肝細(xì)胞生物反應(yīng)器和白蛋白透析解毒單元^【123】,，對8例患者進(jìn)行治療，治療7 - 144 h后,，臨床和實驗室參數(shù)有改善,。

4.6   RFB設(shè)備（Radial-Flow生物反應(yīng)器)

    該裝置包含一個生物反應(yīng)器，灌注液從反應(yīng)器的中心流到邊緣,，通過固定在特殊兩層聚酯之間上的豬的肝細(xì)胞(重量200 - 230 g)^【124】,。第一階段臨床試驗，7例急性肝衰竭患者經(jīng)過治療,，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀改善,，血氨和膽紅素下降，無并發(fā)癥發(fā)生,。

4.7   “生物型人工肝”設(shè)備（“BAL”)

      烏拉爾南部州立大學(xué)與Miass的醫(yī)療設(shè)備工廠合作,，最終設(shè)計出“BAL”。臨床研究證實,，通過細(xì)胞溶質(zhì)和白蛋白透析,，其治療效果顯著^【31】。目前,，體外循環(huán)解毒治療的流程很復(fù)雜,，通過計算機建立軟件來控制這一過程，原則包括模塊化,、開放性,、兼容性和信息安全。軟件的元素包括用戶界面類型和組成，面板電腦,，以及六個體外血液凈化醫(yī)療模塊 (見下表),。

最近的薈萃分析提出，對19項急性肝衰竭或慢性肝衰竭急性加重患者行“生物型人工肝”治療的隨機對照研究進(jìn)行分析(566例急性肝衰竭患者和371例慢性肝衰竭急性加重),。研究發(fā)現(xiàn),，在急性“生物型人工肝”治療時，慢性肝衰竭急性加重患者的死亡率明顯下降,，肝移植前準(zhǔn)備時間明顯縮短,；而急性肝衰竭患者的死亡率及肝移植前準(zhǔn)備時間受影響不大 ^【125】。

結(jié)論

 關(guān)于“生物型人工肝”的研究已經(jīng)有20多年,，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),，其可以顯著改善肝衰竭動物的生存率。然而,，把它引入臨床仍需要解決一些重要的問題。其中一些問題與臨床對照試驗的組織有關(guān),，而另一些則與設(shè)備和生物技術(shù)有關(guān),。臨床上需要的“生物型人工肝”，要具備最優(yōu)化的肝細(xì)胞質(zhì)量和來源,，使得血液/血漿與肝細(xì)胞進(jìn)行高效率的物質(zhì)交換,；要維持肝細(xì)胞生存的體外條件；改善細(xì)胞隔離技術(shù),、肝細(xì)胞的培養(yǎng)和低溫貯藏技術(shù),。治療過程中，需要監(jiān)測患者的生理,、生化和血流動力學(xué)狀態(tài),，還要有對目標(biāo)材料和細(xì)胞進(jìn)行操作的適當(dāng)場所。