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上周我們?yōu)榇蠹抑v解了二代測序的開山鼻祖，Roche公司的454測序技術,。 這周,，讓我們來聊一聊,，ABI公司的SOLiD測序技術。  歷史 ABI公司的SOLiD測序技術最初是由哈佛大學 Church 研究小組成員Shendure等所發(fā)明的,，該技術由連接酶測序法發(fā)展而來,。 Church 研究組發(fā)明的方法的一部分授權給了Agen-court 公司，該公司在 2006年7月被美國應用生物系統(tǒng)公司 (Applied Biosystems lnc, ABI) 收購,，組建 SOLiD 測序平臺,。 原理 SOLiD測序技術以8堿基四色熒光標記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應,，可對單拷貝DNA片段進行大規(guī)模擴增和高通量并行測序,。 SOLiD 測序儀也采用了454技術中乳液PCR 與微球相結合的策略來擴增DNA 模板，其采用邊連接反應邊進行合成測序,，而不是采用聚合反應,。 （小編提示：乳液PCR的知識上周剛講過哦！）  測序步驟 步驟 1丨文庫制備 1.文庫制備 SOLiD 測序平臺支持兩種測序文庫,，一種是片段文庫,，另一種為末端配對文庫。 片段文庫就是將基因組DNA打斷,，在片段的 DNA 模板兩端加上接頭制成文庫,，長度一般為60-110bp。片段文庫主要用于RNA-seq,、重測序,、3’, 5’-RACE、甲基化分析,、ChIP-seq等,。 末端配對文庫是將DNA打斷后，與中間接頭連接,，再環(huán)化,，然后用EcoP15酶切，使中間接頭兩端各有27bp的堿基,，再加上兩端的接頭形成文庫,，長度一般為120-180 bp。該文庫主要應用于全基因組測序,、SNP分析,、結構重排、CNV等,。 步驟 2丨PCR擴增 SOLiD的PCR過程和上周講過的Roche 454測序技術的方法類似,，同樣采用小水滴的乳液 PCR，但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多，只有1um,。 在微反應器中加入測序模板,、PCR反應元件、微珠和引物,，進行乳液PCR,。PCR反應結束后，磁珠表面就固定有拷貝數目巨大的同一DNA模板的擴增產物,。 步驟 3丨微珠沉積 乳液PCR 完成之后,，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠,，微珠上的模板經過3’修飾,，可以與玻片共價結合，SOLiD測序反應就在SOLiD玻片表面進行,。每個磁珠經SOLiD測序后得到一條序列,。  SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實現更高的通量,。 步驟 4丨連接測序 SOLiD測序第二大特點便是雙堿基編碼原理,。測序時向體系中加入DNA連接酶、通用測序引物n和具有3'-XXnnnzzz-5'結構的8聚核苷酸測序探針,，探針5'末端分別標記了CY5、Texas Red,、CY3,、6-FAM這4種顏色的熒光染料。  詳細介紹一下探針： 3'-XXnnnzzz-5' 第1,、2位（XX）上的堿基是確定的,，用來測定模板序列，并第1和2位核苷酸序列（XX）與5′端的熒光標記的種類相對應,。 第3～5位的（nnn）表示表示隨機序列的核苷酸,。 第6～8位的（zzz）指的是可以和任何堿基配對的特殊堿基（該堿基在探針結合后會被切除）。 單向SOLiD測序包括5輪測序反應,，每輪測序反應含有多次連接反應, 得到原始顏色序列,。 每一組讀序只能讀兩個堿基，空三個堿基,，再讀兩個堿基,，以此類推，下一組通過加入紐帶探針和改變引物位置使讀序框向右移動,，確保每個堿基都能讀到,。  SOLiD序列分析軟件根據“雙堿基編碼矩陣”把堿基序列轉換成顏色編碼序列，然后與SOLiD原始顏色序列進行比較。SOLiD序列分析軟件可以對測序錯誤進行自動校正,，最后解碼成原始基因序列,。 應用領域 ABI 的 SOLiD 測序平臺未退出市場之前是二代測序平臺中精準度最高的平臺，測序準確率較高,，然而讀長較短,，運行較慢，常用于外顯子測序,，基因突變測序,。 但是，因為市場競爭和公司發(fā)展等諸多原因,，目前該測序平臺也已經淡出市場,。 |
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來自： 劉得光3p6n6zqq > 《NGS技術》
