miR-644a作為一個較新的miRNA,，從PubMed上也只搜索到了三篇相關(guān)的文獻，最早報道是源于2012年P(guān)los One,。前天的一篇miR-644a很多人覺得發(fā)得比較虧,，有人覺得可以發(fā)到Cancer Research上。

今天我們就來看一篇Clin Cancer Res上的miR-644a,。

Downregulation of MicroRNA-644a Promotes Esophageal Squamous Cell Carcinoma Aggressiveness and Stem-cell-like Phenotype via Dysregulation of PITX2. （Clin Cancer Res,，Jul 12 2016）

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PITX2是Wnt通路下游效應(yīng)分子，能激活細(xì)胞增殖,、生存的靶標(biāo)基因的表達,。

miR-644a在腫瘤組織中低表達，該miR-644a能減弱ESCC的惡性程度,、抑制干細(xì)胞特性,。它與PITX2呈表達負(fù)相關(guān)。通過下調(diào)miR-644a能直接上調(diào)PITX2從而激活Akt/GSK-3β/β-catenin通路,，增強腫瘤細(xì)胞的侵襲性,。另外啟動子的超甲基化作用是ESCC下調(diào)miR-644a表達的主要原因。

看一下主要思路,，太長不看版看標(biāo)題：

1,、首先，依然是找目標(biāo)分子,，找關(guān)系

作者通過miRANDA預(yù)測軟件,，結(jié)合NCBI/GEO/GSE23142前期報道在ESCC下調(diào)的miRNAs，取交集發(fā)現(xiàn)了miRNA-644a,。

PITX2作為Wnt通路下游效應(yīng)分子,，能激活細(xì)胞增殖生存的靶標(biāo)基因的表達。下面就開始驗證miR-644a與PITX2作用關(guān)系,。

a,、miR-644a在腫瘤組織與腫瘤細(xì)胞中下調(diào)的。b,、在PITX2高表達的樣本或細(xì)胞中miR-644a是低表達的,。確定了兩者的表達呈負(fù)相關(guān),。

與臨床結(jié)合，miR-644a與PITX2與預(yù)后相關(guān),。miR-644a表達越低,，ESCC病人手術(shù)后越容易發(fā)生復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。相反,，高表達miR-644a病人預(yù)后較好,。

2、miR-644a體外及體內(nèi)的功能研究

PITX2的mRNA存在一個與miR-644a種子域互補的序列,。且驗證了,，它們之間就是通過這個區(qū)域結(jié)合。

還是細(xì)胞實驗,，驗證miR-644a對腫瘤細(xì)胞增殖,、克隆形成、遷移,、侵襲作用的影響,。

實驗發(fā)現(xiàn)，miR-644a能抑制腫瘤細(xì)胞的一些特性,，如減慢細(xì)胞增殖與克隆形成,，抑制細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移作用。表明了miR-644a有抑癌作用,，跟前天那篇miR-644a的結(jié)論一樣（并不是絕對的哦,，說不定在不同的腫瘤細(xì)胞中也會存在雙面間諜的作用）。

接著是動物實驗驗證,。首先miR-644a能抑制腫瘤生成,，其次H&E染色發(fā)現(xiàn)，對照組中腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出分叉狀生成形式,，并擴散到周邊組織,。而過表達miR-644a的腫瘤細(xì)胞呈圓滑狀，無侵潤狀態(tài),。

并且,，小鼠轉(zhuǎn)移模型發(fā)現(xiàn)，注射過表達miR-644a細(xì)胞的小鼠,，肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)要少很多,。

3、機制研究,。

依然從細(xì)胞實驗引出：共過表達miR-644a,、PITX2引發(fā)抑制細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲與轉(zhuǎn)移作用,。但這種作用沒有單純過表達miR-644a效果來得高,。反向驗證沉默PITX2也能引起上述作用。這部分內(nèi)容驗證了第一部分內(nèi)容,。

這里如果再加一個干擾掉過表達miR-644a細(xì)胞中PITX2，確認(rèn)細(xì)胞的表型,，才能更加說明問題：miR-644a通過PITX2起作用,。

那么這種調(diào)控作用的關(guān)系是什么樣的呢？

前期報道,，PITX2關(guān)聯(lián)Wnt/β-catenin通路,。通過實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-644a的ESCC細(xì)胞中，β-catenin及相關(guān)下游基因的表達顯著下降,。同時顯示出β-catenin胞漿與胞核中重分配（定位胞漿,。而Wnt經(jīng)典通路中，β-catenin定位于胞核,，促進基因表達）,，這里說明miR-644a調(diào)控了Wnt/β-catenin。

另外,，β-catenin與下游基因Lef-1 ,、c-myc啟動子區(qū)TCF位點結(jié)合減低（TCF參與Wnt/β-catenin通路）。

另外,，作者通過TOP/FOP flash熒光實驗（測定細(xì)胞內(nèi)beta-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性的方法）發(fā)現(xiàn)報告基因的表達受到miR-644a抑制,，表明miR-644a抑制β-catenin轉(zhuǎn)錄。

這部分內(nèi)容說明,，miR-644a通過抑制PITX2表達,，來阻遏激活Wnt/β-catenin通路。

4,、體外體內(nèi)細(xì)胞干性相關(guān)實驗-Wnt/β-catenin通路

激活Wnt/β-catenin通路被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦杉?xì)胞樣特征的主要原因,，而且這種干細(xì)胞樣特別對腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移起到作用。上述第三部分內(nèi)容已經(jīng)證實,，miR-644a能阻遏Wnt/β-catenin通路,，所以，作者猜測miR-644a是否能抑制細(xì)胞獲得干細(xì)胞樣特征,。

過表達miR-644a后檢測多種細(xì)胞干性相應(yīng)的分子,，發(fā)現(xiàn)這些分子的表達都降低了。且細(xì)胞呈更小更少的球狀,，并對化療藥物敏感,！并且干擾PITX2也能起到相同作用。

裸鼠成瘤實驗發(fā)現(xiàn),，過表達miR-644a小鼠體內(nèi)的腫瘤生長速度大小均變慢,。另外檢測了腫瘤組織樣本中的干性相關(guān)分子的表達,，確認(rèn)與miR-644a的表達呈負(fù)相關(guān)，和細(xì)胞實驗一致,。

5,、細(xì)胞侵潤，成球能力-Akt/GSK-3β/β-catenin通路

前期報道Akt激活抑制GSK-3β,，隨后激活Wnt/β-catenin通路,。

作者通過過表達miR-644a，檢測細(xì)胞中PITX2, p-Akt, p-GSK-3β (非激活態(tài)) ,，active-β-catenin表達下調(diào),。并且通過rescue實驗，將PITX2轉(zhuǎn)染到過表達miR-644a中,，能恢復(fù)上述蛋白的表達,。這表明miR-644a通過PITX2來抑制Akt/GSK-3β/β-catenin通路。

并且在組織樣本中也驗證了miR-644a與PITX2, p-Akt, p-GSK-3β 表達呈負(fù)相關(guān),。

這邊作者做一個乙?；{(diào)控實驗：已知Akt賴氨酸乙酰化調(diào)控其磷酸化和激活作用,，隨后調(diào)控下游效應(yīng)分子,。作者想了解一下miR-644a是否參與Akt， GSK-3β ,， β-catenin乙?；饔谩嶒灠l(fā)現(xiàn)過表達miR-644a能顯著提升Akt乙?；?，另外過表達PITX2則能抑制這種作用。這表明在ESCC中,，miR-644a抑制PITX2調(diào)控Akt乙?；?/span>

6,、上面的研究圍繞著miR-644a參與調(diào)控作用而設(shè)計的,。事實上，在腫瘤組織中miR-644a是低表達的,。而這種下調(diào)作用的原因,，才是連接臨床治療的關(guān)鍵。

miR-644a是ITCH基因內(nèi)含子編碼,，其在ESCC中的表達與ITCH的mRNA表達水平相關(guān),。通過UCSC數(shù)據(jù)庫分析ITCH啟動子區(qū)，其CpG島位于轉(zhuǎn)錄起始位點-285 bp 至 -56 bp區(qū)。隨后BGS(重亞硫酸鹽基因組測序)PCR（啟動子甲基化分析）,，發(fā)現(xiàn)在miR-644a低表達的ESCC細(xì)胞株與樣本中,，ITCH啟動子區(qū)（與miR-644a共表達）超甲基化。隨后,，使用甲基化抑制劑處理低表達miR-644a細(xì)胞株,，發(fā)現(xiàn)能恢復(fù)miR-644a的表達。這表明,，ESCC中miR-644a低表達歸咎于其啟動子超甲基化,。

總結(jié)一下：找分子，細(xì)胞實驗（表型）,，動物實驗（表型驗證）,，有表型了扯通路及明星分子,，找機制,。

That’s all. Thank you!