【關(guān)鍵詞】宮頸腫瘤,；診斷技術(shù)和方法,；人乳頭瘤病毒

【中圖分類號(hào)】R737.3     【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】C

        病因?qū)W和流行病學(xué)研究已證明，持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus,，HPV）是子宮頸癌發(fā)生的必要條件,。宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是重要的子宮頸癌前病變,，從CIN發(fā)展為浸潤(rùn)性子宮頸癌大約需要10~20年［1］,，為子宮頸癌的篩查提供了有利時(shí)機(jī)。隨著HPV檢測(cè)技術(shù)的突破和HPV疫苗的上市,，子宮頸癌有望成為第一個(gè)可通過(guò)綜合性預(yù)防措施消除的惡性腫瘤,。

        一,、HPV和子宮頸癌的關(guān)系

      （一）HPV

        HPV是一組嗜上皮組織的病毒,，屬乳多空病毒科A組，其基因組為一閉環(huán)雙鏈DNA,，長(zhǎng)度在7 200~8 000 bp之間,，可分為長(zhǎng)控區(qū)（long control region, LCR）、早期區(qū)和晚期區(qū),。LCR包含復(fù)制起始區(qū)和轉(zhuǎn)錄控制元件,，雖不具有編碼功能，但能夠影響病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制,，早期區(qū)包含6個(gè)不同的開(kāi)讀框架（E1,，E2，E4,，E5,，E6和E7），主要控制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)化功能,，晚期區(qū)（L1和L2）編碼病毒的衣殼蛋白［2］,。

        依據(jù)各型別HPV與癌發(fā)生的關(guān)系,，可將其分為低危型（如6、11,、42,、43、44等）和高危型（如16,、18,、31、33,、35等）,，高危型HPV感染能夠引起宮頸上皮內(nèi)高度病變和子宮頸癌。在高危型中,，以HPV16,、18型的感染率最高，致癌性最強(qiáng),，其在浸潤(rùn)性子宮頸癌中的檢出率分別為61%和10%［3］,。一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)10年的前瞻性研究顯示，在基線細(xì)胞學(xué)篩查為陰性,、意義不明確的非典型鱗狀上皮增生（atypical squamous cells of undetermined significance,，ASC-US）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low grade squamous intraepithelial lesion,，LSIL）,、HPV 16陽(yáng)性的婦女進(jìn)展為CINⅢ及以上的可能性是17.2%，HPV 18陽(yáng)性的是13.6%,，其它高危型陽(yáng)性的是3.0%,，高危型HPV陰性的僅為0.8%［4］。

        HPV主要通過(guò)性接觸傳播,，在性活躍婦女中感染率高達(dá)20%~40%,，有性行為的婦女至少感染一種HPV的終生累積概率約為70%［5］。但是,，90%以上的HPV感染都可在感染后2年內(nèi)被機(jī)體清除,，只有不到1%進(jìn)展為子宮頸癌。

       （二）HPV的致癌機(jī)制

        高危型HPV感染是子宮頸癌前病變和子宮頸癌發(fā)生的必要條件,。研究表明相對(duì)于HPV檢測(cè)陰性的婦女,，HPV陽(yáng)性者子宮頸癌發(fā)生的相對(duì)危險(xiǎn)度高達(dá)250，歸因危險(xiǎn)百分比超過(guò)95%［5］,。HPV感染基底層細(xì)胞后,，主要以游離態(tài)和整合態(tài)兩種形式存在。HPV DNA在良性病變中多以游離態(tài)存在,，在癌前病變和癌中多以整合態(tài)存在,，約90%的子宮頸癌組織中可檢測(cè)到HPV DNA整合的存在［6］,。整合發(fā)生時(shí)，E1,、E2,、E5及大部分的殼蛋白基因序列斷裂缺失，而E6和E7基因及上游的LCR被選擇性保留,。E2基因編碼的E2蛋白可抑制E6,、E7基因啟動(dòng)子的活性，而其缺失會(huì)造成E6,、E7的持續(xù)性高表達(dá),。作為子宮頸癌發(fā)生最重要的癌基因，E6和E7基因通過(guò)mRNA的轉(zhuǎn)錄生成的相應(yīng)的癌蛋白,，E6癌蛋白經(jīng)E6-AP（E6 associated protein）介導(dǎo),，通過(guò)結(jié)合并降解p53抑癌蛋白、激活端粒酶等途徑最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生,；E7癌蛋白通過(guò)結(jié)合并降解pRb抑癌蛋白,、與AP-1(activator praotein-1)轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合等途徑致癌［7］。另外,，二者還可通過(guò)協(xié)同作用使中心體復(fù)制與細(xì)胞周期脫藕聯(lián),，干擾紡錘體監(jiān)測(cè)點(diǎn)功能，導(dǎo)致中心體數(shù)目變化,、分裂和基因組完整性變化,，進(jìn)一步導(dǎo)致癌變［8］。HPV的分子結(jié)構(gòu)和致癌機(jī)制是其檢測(cè)方法研發(fā)的基礎(chǔ),。

        二,、HPV與子宮頸癌篩查

        （一）HPV檢測(cè)方法

        依據(jù)檢測(cè)目標(biāo)物的不同，可將檢測(cè)方法分為DNA類,、mRNA類,、蛋白類及基因組甲基化類等。

        1．高危型HPV DNA檢測(cè)技術(shù)：第一個(gè)通過(guò)美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration,，F(xiàn)DA）認(rèn)證的高危型HPV檢測(cè)技術(shù)為第二代雜交捕獲法（hybrid capture 2 ，hc2),，能夠檢測(cè)13種高危型（16,、18、31,、33,、35、39,、45,、51,、52、56,、58,、59和68），但不能具體分型,。2012年底通過(guò)中國(guó)食品藥品管理局（China Food and Drug Administration,，CFDA）認(rèn)證的care HPV檢測(cè)能夠檢測(cè)14種高危型。研究顯示,，在醫(yī)生取樣和自取樣標(biāo)本中care HPV對(duì)CINⅢ及以上檢測(cè)的靈敏度與hc2相近,，這項(xiàng)低成本檢測(cè)技術(shù)為發(fā)展中國(guó)家婦女子宮頸癌的篩查帶來(lái)了福音，但不能對(duì)HPV進(jìn)行具體分型［9］,。

        由羅氏診斷公司研發(fā)cobas 4800 HPV檢測(cè)系統(tǒng)和雅培公司研發(fā)的m2000 HPV檢測(cè)系統(tǒng)能夠全自動(dòng)檢測(cè)14種高危型HPV,，并能夠?qū)PV 16、18進(jìn)行分型,。這兩種技術(shù)首先通過(guò)自動(dòng)化樣品制備提取細(xì)胞及HPV DNA,，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的目標(biāo)DNA序列與其相應(yīng)的探針結(jié)合,，檢測(cè)的熒光通道有四種,，分別是HPV 16、HPV 18,、β-球蛋白及12種高危型HPV (31,、33、35,、39,、45、51,、52,、56、58,、59,、66和68)，最終通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)確定樣本中HPV的種類和含量,。目前已有多個(gè)研究證實(shí)兩種檢測(cè)方法在子宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值［10-14］,。值得一提的是，由美國(guó)BD公司研發(fā)的BD Onclarity HPV檢測(cè)系統(tǒng)也可同時(shí)檢測(cè)14種高危型HPV,，但該法將HPV DNA檢測(cè)區(qū)域從傳統(tǒng)的L1區(qū)轉(zhuǎn)變?yōu)镋6/E7區(qū),；雖有研究證實(shí)其與hc2一致性較好［15］，但仍需更大規(guī)模的人群驗(yàn)證,。

        美國(guó)Hologic公司研發(fā)的Cervista高危型HPV檢測(cè)技術(shù)能夠利用3組寡核苷酸混合探針同時(shí)檢測(cè)14種高危型HPV,，并且將能與人2型組蛋白基因結(jié)合的寡核苷酸作為內(nèi)部質(zhì)控,。Cervista不與低危型HPV發(fā)生交叉反應(yīng)，研究表明該法與hc2 的檢測(cè)一致性好,，檢出CINⅢ的靈敏度和特異度均與hc2相近［16］,。此外還有Cervista 16/18 HPV檢測(cè)技術(shù)可對(duì)Cervista檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性者分流。

         2．HPV E6,、E7mRNA /蛋白檢測(cè)：由美國(guó)Hologic公司研發(fā)的APTIMA HPV技術(shù)能夠檢測(cè)14種高危型HPV（與cobas 4800一致）的E6/E7mRNA,，但不能具體分型。該技術(shù)通過(guò)高通量的TIGRIS系統(tǒng)自動(dòng)完成樣品制備,、檢測(cè)及結(jié)果輸出,，目前已通過(guò)FDA和CFDA批準(zhǔn)。研究表明,，APTIMA HPV檢測(cè)可用于ASC-US和LSIL的分流,，與hc2相比較檢測(cè)靈敏度相近，特異性更好［17］,。除此之外,，用于HPV mRNA檢測(cè)的還有NucliSENSEasyQ、OncoTect及PreTect Proofer等技術(shù),。

        美國(guó)Arbor Vita公司研發(fā)了一種低成本,、可提供即時(shí)檢測(cè)結(jié)果的分子檢測(cè)法—子宮頸E6癌蛋白檢測(cè)，該法是一種“試紙條”形式的捕獲實(shí)驗(yàn),，通過(guò)在硝酸纖維素膜上包被特異性的E6單克隆抗體捕獲待測(cè)物中的 HPV E6蛋白,，形成的復(fù)合物與堿性磷酸酶—抗E6單克隆抗體試劑結(jié)合，然后與加入的酶底物發(fā)生顯色反應(yīng)從而在試紙條上顯現(xiàn)出相應(yīng)條帶,。為評(píng)價(jià)該技術(shù)作為初篩手段及HPV DNA陽(yáng)性分流方法的可行性,，探索適合欠發(fā)達(dá)地區(qū)的子宮頸癌篩查技術(shù)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院在山西,、江西,、河南省開(kāi)展了一項(xiàng)研究，共納入了7 500名25~65歲的婦女,，對(duì)其進(jìn)行了HPV DNA,、E6癌蛋白檢測(cè)、細(xì)胞學(xué)檢查及醋酸染色的肉眼觀察,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPV E6癌蛋白技術(shù)檢測(cè)CINⅢ及以上的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為40.8%,，遠(yuǎn)高于其他各種檢測(cè)方法（<10%），說(shuō)明HPV E6癌蛋白檢測(cè)對(duì)于鑒別癌前病變有極高的應(yīng)用價(jià)值［9］,。但該法的低靈敏度（不足60%）將其使用范圍限制在作為HPV DNA檢測(cè)分流方法或在低收入國(guó)家作為初篩方法［18-19］。

        3．HPV基因組甲基化檢測(cè)：DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要的分子機(jī)制之一,，有研究表明HPV 16型的基因甲基化與CINⅡ及以上病變具有相關(guān)關(guān)系［20］,。Brandsma等［21］對(duì)不同疾病狀態(tài)的子宮頸標(biāo)本中HPV 16全基因組甲基化狀態(tài)進(jìn)行了分析,，結(jié)果顯示，病毒E5,、L2和L1區(qū)的甲基化水平的增加與疾病嚴(yán)重程度相關(guān),。Mirabello等［22］檢測(cè)了CINⅢ及以上和正常婦女細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中HPV 16 DNA L1、L2,、E2/E4三個(gè)位點(diǎn)的甲基化情況,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個(gè)位點(diǎn)的高甲基化與子宮頸癌相關(guān)，合并比值比高達(dá)52,，提示HPV 16 DNA甲基化可能作為子宮頸癌篩查的新指標(biāo),。目前甲基化的檢測(cè)技術(shù)主要是重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)，即變性后的DNA先經(jīng)重亞硫酸氫鈉處理,，DNA序列中未被甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶,，甲基化的胞嘧啶因甲基化基團(tuán)的保護(hù)而保持不變，然后使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，PCR擴(kuò)增時(shí)甲基化的胞嘧啶保持不變,，而沒(méi)有甲基化的胞嘧啶則變成了胸腺嘧啶。通過(guò)測(cè)序法測(cè)定PCR產(chǎn)物各個(gè)CpG位點(diǎn)的平均甲基化狀態(tài),，從而定性或定量的檢測(cè)目標(biāo)DNA的甲基化狀態(tài),。鑒于目前還沒(méi)有建立成熟HPV DNA甲基化檢測(cè)指標(biāo)，因此需要研究者對(duì)不同HPV型別的各甲基化區(qū)域進(jìn)行更廣泛的研究和評(píng)估,。

       （二）HPV檢測(cè)在子宮頸癌篩查中的應(yīng)用

        以細(xì)胞學(xué)檢測(cè)為基礎(chǔ)的篩查方法在發(fā)達(dá)國(guó)家成功地降低了子宮頸癌的發(fā)病率和死亡率,。但是，它易受臨床醫(yī)生采樣,、細(xì)胞學(xué)醫(yī)生專業(yè)水平,、標(biāo)本運(yùn)輸儲(chǔ)存不便等諸多因素的影響，從而制約了其在發(fā)展中國(guó)家的推廣應(yīng)用,。2012年,，美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)（American Cancer Society, ASC）、美國(guó)陰道鏡和宮頸病理協(xié)會(huì)（American Society for Colposcopy and Cervical Pathology,，ASCCP）和美國(guó)臨床病理協(xié)會(huì)（American Society for Clinical Pathology,，ASCP）發(fā)表了關(guān)于子宮頸癌篩查的聯(lián)合建議，對(duì)30~65歲女性每5年進(jìn)行一次細(xì)胞學(xué)和HPV聯(lián)合篩查或者每3年進(jìn)行一次細(xì)胞學(xué)篩查,。HPV DNA檢測(cè)自此正式成為國(guó)際公認(rèn)的子宮頸癌篩查方法,。2014年，美國(guó)FDA通過(guò)了將cobas 4800 HPV DNA檢測(cè)作為子宮頸癌初篩的手段,，HPV檢測(cè)在子宮頸癌篩查中的意義愈發(fā)重大,。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)HPV DNA類檢測(cè)技術(shù)獲批可用于子宮頸癌初篩。

        1．用作子宮頸癌的初篩手段：HPV DNA檢測(cè)作為初篩手段可以濃縮高風(fēng)險(xiǎn)人群,，在細(xì)胞學(xué)檢查不能推廣的地區(qū)可考慮作為子宮頸癌初篩方法,。一項(xiàng)綜合17個(gè)研究納入3萬(wàn)多人的薈萃分析顯示［23］，以HPV DNA檢測(cè)（hc2）作為初篩方法,，檢測(cè)CINⅢ及以上的靈敏度可達(dá)97.5%,，高于細(xì)胞學(xué)檢查（87.9%），但其特異度較差（85.1% VS.94.7%）,；提高HPV DNA檢測(cè)界值,，可適當(dāng)提高特異性，降低轉(zhuǎn)診率,；在35歲以下年齡組中,，提高檢測(cè)界值可在維持高靈敏性的同時(shí)（97.7%）將特異性提升至93.5%，該結(jié)果證實(shí)了HPV DNA檢測(cè)可用于子宮頸癌初篩,。Ronco等［24］匯總了歐洲四個(gè)國(guó)家（比利時(shí),、瑞典、荷蘭,、意大利）的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果,，對(duì)HPV檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)檢查用作初篩方法進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn),，在首輪隨訪中（2.5 年）,，兩種篩查方法對(duì)浸潤(rùn)性子宮頸癌的檢出效果相似，而在更長(zhǎng)期的第3.5年和5.5年隨訪中HPV陰性者浸潤(rùn)性子宮頸癌累積發(fā)生率低于細(xì)胞學(xué)陰性者,。由此得出,，基于HPV的篩查方法預(yù)測(cè)浸潤(rùn)性子宮頸癌的效果相較于細(xì)胞學(xué)檢查提高了60%~70%，肯定了HPV檢測(cè)的長(zhǎng)期保護(hù)作用,。盡管如此,，我們不能忽視的問(wèn)題是對(duì)高危型HPV檢測(cè)陽(yáng)性者的管理，因多數(shù)的HPV感染為一過(guò)性,，而目前的檢測(cè)技術(shù)尚不能區(qū)分出持續(xù)感染或有潛在高度病變的婦女,。因此，需要特異度高的分流方法配合使用,，減小不必要隨訪,，節(jié)約衛(wèi)生資源。

        2．對(duì)細(xì)胞學(xué)診斷為ASC-US的婦女進(jìn)行分流管理：研究表明,，細(xì)胞學(xué)診斷為ASC-US的婦女在5年后進(jìn)展為CINⅢ及以上的概率為2.6%［25］,，將其直接轉(zhuǎn)診不具有成本效益，對(duì)大部分婦女也是不必要的,，會(huì)造成衛(wèi)生資源的浪費(fèi),。ASC-US婦女的HPV感染率為30%~60%，ATHENA［26］研究發(fā)現(xiàn)HPV陽(yáng)性和HPV陰性的ASC-US婦女中發(fā)生CINⅢ及以上病變的風(fēng)險(xiǎn)分別為8.4%和0.28%。因此,，以HPV檢測(cè)作為ASC-US婦女的分流方法極具意義,。

        Solomon等［27］在一項(xiàng)納入了3 488名ASC-US婦女的研究中評(píng)估了hc2的分流能力,，結(jié)果顯示其對(duì)CINⅢ及以上病變的檢測(cè)靈敏度高達(dá)96.3%,，相應(yīng)的轉(zhuǎn)診率為56.1%。Stoler等［28］對(duì)APTIMA HPV技術(shù)分流ASC-US的能力進(jìn)行了評(píng)估,，研究納入了939例細(xì)胞學(xué)診斷為ASC-US的婦女,，發(fā)現(xiàn)APTIMA HPV檢測(cè)CINⅡ及以上的靈敏度和特異度分別為86.8%、62.9%,，檢測(cè)CINⅢ及以上的靈敏度和特異度分別是90.2%,、60.2%，以APTIMA HPV檢測(cè)作為分流措施,，可以降低一半的陰道鏡轉(zhuǎn)診,。除應(yīng)用于篩查外，HPV檢測(cè)在臨床上還可用于子宮頸病變治療后的療效監(jiān)測(cè),，因子宮頸癌前病變的各種保守治療方法的總有效率為90%~95%,，80%~90%的治療失敗發(fā)生在術(shù)后2年內(nèi)，而且經(jīng)保守治療的CIN患者發(fā)生浸潤(rùn)癌的風(fēng)險(xiǎn)仍為普通人群的4~5倍,。有研究回顧性比較了子宮頸病變進(jìn)行局部保守治療后HPV檢測(cè),、宮頸細(xì)胞學(xué)、切緣情況對(duì)5年內(nèi)發(fā)生CIN的檢出能力,。結(jié)果顯示,，HPV檢測(cè)的靈敏度明顯高于后兩者，分別為93%,、49%,、39%；三者特異度相似,，為78%~84%［29］,。

        三、HPV感染處理原則

        目前對(duì)于HPV檢測(cè)結(jié)果的處理,，主要是治療病變而非感染,。在實(shí)際工作中，將HPV檢測(cè)與細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)結(jié)合加以抉擇是明智的,。2012年美國(guó)子宮頸癌篩查指南中,，對(duì)于聯(lián)合篩查中細(xì)胞學(xué)陰性、HPV陽(yáng)性的女性,，應(yīng)該依照以下兩種途徑之一進(jìn)行處理：1.12個(gè)月后重復(fù)聯(lián)合檢測(cè),。如果重復(fù)的細(xì)胞學(xué)檢查為L(zhǎng)SIL及以上病變，或HPV仍為陽(yáng)性，建議患者行陰道鏡檢查,。反之,，建議患者回到常規(guī)篩查程序；2.即刻行HPV 16或HPV 16/18的HPV分型檢測(cè),。HPV 16或HPV 16/18陽(yáng)性患者應(yīng)轉(zhuǎn)診直接行陰道鏡檢查,。HPV 16或HPV 16/18檢測(cè)陰性者，應(yīng)在12個(gè)月后重復(fù)聯(lián)合篩查,。

       目前治療HPV感染藥物多為干擾素類,，都不能直接消滅病毒，而其是否有益于HPV清除尚無(wú)定論,。

        綜上所述,，高危型HPV與子宮頸癌病因關(guān)系的確立帶來(lái)了子宮頸癌篩查技術(shù)的重大變革。在發(fā)展中國(guó)家,，由于經(jīng)濟(jì),、醫(yī)療水平等的限制，建立完善的細(xì)胞學(xué)篩查體系比較困難,，這使得HPV檢測(cè)有良好的應(yīng)用前景,。HPV檢測(cè)可以優(yōu)化子宮頸癌篩查方案，協(xié)助處理不確定的細(xì)胞學(xué)結(jié)果,。在實(shí)際工作中,，應(yīng)結(jié)合具體情況，選擇最適合的篩查和分流技術(shù),，降低子宮頸癌的發(fā)生,。

參考文獻(xiàn)略（詳見(jiàn)雜志官網(wǎng)）