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一,、知識(shí)背景： 1. 基因表達(dá)：DNA——RNA——Protein 單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因——104個(gè)絲心蛋白mRNA（每個(gè)mRNA存活4d,，可以合成105個(gè)絲心蛋白）——共合成109個(gè)絲心蛋白 ,。因此單拷貝基因的mRNA表達(dá)水平對(duì)于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。 2. PCR技術(shù)(Polymerase chain reaction)： 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),。 在模板,、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個(gè)人工合成的引物序列決定,。反應(yīng)分三步： A.變性：通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA； B.退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度,，使引物與模板結(jié)合,。 C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下,，退火引物沿5‘ —— 3’方向延伸。 以上三步為一個(gè)循環(huán),，如此反復(fù),。 3. 逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性： (1)依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈,； (2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA,； (3)依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA. 二、RT-PCR的準(zhǔn)備： 1. 引物的設(shè)計(jì)及其原則： (1)引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性,。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響,。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型,，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對(duì)引物的特異性的影響,。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過(guò)程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子,。 (2)引物設(shè)計(jì)原則的把握：引物設(shè)計(jì)原則包括: a.引物長(zhǎng)度:一般為15～30 bp ,，引物太短會(huì)影響PCR的特異性，引物太長(zhǎng)PCR的最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq酶的最適溫度,，也影響反應(yīng)的特異性,。 b.堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在,，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上的單一堿基,。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去5～10度,。 c.3‘端要求：3’端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ),，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能,。末位堿基是A時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率最低,，G、C居中間,，因此引物的3’端最好選用A,、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)以上的T,。 d.引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,，否則會(huì)自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。 e.引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ),，3’端不應(yīng)超過(guò)2個(gè),。 f.同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基存在。 g.5’端無(wú)嚴(yán)格限制：5’末端堿基可以游離，但最好是G或C,，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定,。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等,。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對(duì)于這些條件都可以自行設(shè)置,。 2. 耗材： 實(shí)驗(yàn)所用的接觸樣品的耗材如凍存管,、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過(guò)0.1%DEPC水浸泡處理,，除去RNA酶,，防止操作過(guò)程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）,。 3. 試劑準(zhǔn)備： 變性液,、水飽和酚、乙酸鈉,、氯仿、異丙醇,、75%酒精,、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。 三,、RNA的提取方法： RT－PCR中從細(xì)胞分離的RNA的質(zhì)量至關(guān)重要,，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染,。但RNA酶活性非常穩(wěn)定,，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶外,，環(huán)境中也存在大量RNA酶,。因此在提取RNA時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境,，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性,，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過(guò)RNA酶的阻抑蛋白R(shí)nasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶,。 RT－PCR步驟： 1,、RNA的提取：  2,、cDNA的合成： 逆轉(zhuǎn)錄體系的組成：  3,、PCR擴(kuò)增： 50ul PCR體系的組成：  4、PCR反應(yīng)條件：  四、PCR條件的優(yōu)化： PCR條件的優(yōu)化主要是 ①引物退火溫度的調(diào)節(jié),，一般在引物設(shè)計(jì)軟件推薦溫度的上下2 ℃變化尋找最佳退火溫度,。 ②此外Mg2＋濃度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳濃度為2 mM左右,。 ③引物和模板的量等,。 五、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定： 根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠（不同長(zhǎng)度產(chǎn)物所需凝膠濃度）,，取適量PCR產(chǎn)物,，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中,，10V/cm電泳45－60min,。成像系統(tǒng)成像分析。 分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖濃度  六,、需注意的問(wèn)題： 1. 注意避免有毒,、有害試劑傷害自己和他人：氯仿、溴化乙錠（EB）,、酚,、異硫氰酸胍、紫外線等,。 2. 注意避免試劑污染,。 3. 始終注意避免RNA酶的污染。 4. 保管好自己專用的試劑,，公用試劑保管好,，相互協(xié)調(diào)，注意實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生,。 |
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