一、實驗?zāi)康?/strong> 學(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖電泳法鑒定DNA的原理和方法,。 二,、實驗原理 瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法,。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖,，具親水性,，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物,。DNA在堿性條件下（pH8.0的緩沖液）帶負(fù)電荷,，在電場中通過凝膠介質(zhì)向正極移動，不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同,，在電場中的泳動速率液不同,。溴化乙錠（EB）可嵌入DNA分子堿基對間形成熒光絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后,，可分出不同的區(qū)帶,，達到分離、鑒定分子量,，篩選重組子的目的,。 三、實驗材料 實驗14提取的DNA樣品,， 四,、器具及藥品 電泳儀，電泳槽,，紫外透射反射儀,，恒溫水浴鍋，微波爐,，微量進樣器,，三羥甲基氨基甲烷，鹽酸,，醋酸鈉,，EDTA，瓊脂糖,，溴酚藍,，溴化乙錠。 五,、實驗步驟 1,、安裝電泳槽 將有機玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干,，用膠帶將兩端的開口封好,，放在水平的工作臺上，插上樣品梳,。 2,、瓊脂糖凝膠的制備 稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，（按0.3-1.5%的瓊脂糖含量,，1-25kb大小的DNA用1%的凝膠,，20-100kb的DNA用0.5%的凝膠,，200-2000bp的DNA用1.5%的凝膠）置微波爐或沸水浴中加熱至完全溶化（不要加熱至沸騰），取出搖勻,。 3,、灌膠 將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。 4,、待瓊脂糖膠凝固后,，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，然后拔出梳子,。 5,、加樣 將DNA樣品與加樣緩沖液按4：1混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中,，每槽加10-20μl,，記錄樣品的點樣次序和加樣量。 6,、電泳 安裝好電極導(dǎo)線,，點樣孔一端接負(fù)極，另一端接正極,，打開電源,，調(diào)電壓至3-5V/cm，電泳1-3hr,，當(dāng)溴酚藍移到距凝膠前沿1-2cm時,，停止電泳。 7,、染色和觀察 取出凝膠,，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外燈下觀察,，有橙紅色熒光條帶的位置,，即為DNA條帶,，或在紫外燈下照相記錄電泳圖譜,。溴化乙錠是致癌劑，操作時要小心,，必須戴手套,。 附： ⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）緩沖液的配制(1000ml)： Tris 54g，硼酸27.5g,，0.5mol/LEDTA 20ml,，將pH調(diào)到8.0，定容至1000ml,，4℃冰箱保存,，用時稀釋10倍,。 ⑵加樣緩沖液的配制： 0.25%溴酚藍，40%（W/V）蔗糖水溶液,，4℃冰箱保存,。 ⑶溴化乙錠的配制： 稱取0.1g溴化乙錠，溶于10ml水,，配成終濃度為10mg/ml的母液,，4℃冰箱保存。染色時,，吸取12.5μl的母液,，加入250ml的水中，使其終濃度為0.5μg/ml,，混合均勻,。 ⑷100倍TE緩沖液的配制： 1mol/LTris-HCl（pH8.0），100mmol/LEDTA 稱取Tris121.1g,，EDTA-Na237.23g,，先用800ml雙蒸水，加熱攪拌溶解后,，再用鹽酸調(diào)pH至8.0（大約加入鹽酸20ml）,，然后定容至1000ml。 ⑸100倍電泳緩沖液的配制： 4mol/LTris-HCl（pH8..0）,，2mol/L醋酸鈉,，200mmol/LEDTA 稱取Tris242.2g，無水乙酸鈉82.03g,，EDTA-Na237.23g,，先用400ml雙蒸水加熱攪拌溶解后，再用冰乙酸調(diào)pH至8.0（大約加入冰乙酸50ml）,，然后定容至500ml,。用時稀釋100倍。 相關(guān)熱詞：DNA 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖 凝膠電泳 相關(guān)文章DNA的瓊脂糖凝膠電泳實驗原理和方法步驟
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