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本文針對HPLC使用常見故障進(jìn)行了較全面的分析,如輸液泵中的單向閥,、泵墊圈、色譜柱,、檢測器的常見故障,并結(jié)合日常工作實際,提出了一些可參考的做法和解決對策,。以便使用者能及時注意所述問題,做到有問題及時解決,這樣既能大大延長儀器的使用壽命,又能使儀器的性能得到最大限度的發(fā)揮。
HPLC常見故障因素 不規(guī)則的基線噪音產(chǎn)生原因 ①漏液,。 ②流動相污染,、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成 ③流動相各溶劑不相溶 ④檢測器/記錄儀電子元件的問題 ⑤系統(tǒng)內(nèi)有氣泡 ⑥檢測器內(nèi)有氣泡 ⑦流通池污染（即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音。） ⑧檢測器燈能量不足 ⑨色譜柱填料流失或阻塞 ⑩流動相混合不均勻或混合器工作不正常 以上相應(yīng)解決方法 ④斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正,。 ⑤用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng) ⑥清洗檢測器,，在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器 ⑦用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池 ⑧更換燈 ⑨更換色譜柱 ⑩維修或更換混合器，在流動相不走梯度時,，建議不使用泵的混合裝置 保留時間漂移的故障排除 保留時間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：既保留時間漂移和保留時間波動,。前者是指保留時間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時間無固定規(guī)律的波動,。將此兩種情況區(qū)分開來對找到問題的原因往往很有幫 助,。如，保留時間的漂移往往由柱老化引起,；而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動,。事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過水解）,，色譜柱污染（由樣品或流動相所致）等,。 保留時間漂移的幾種最常見的原因如下：
如果我們觀察到保留時間漂移,，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡,。通常平衡需要10-20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑（如離子對試劑）則需要相當(dāng)長的時間來平衡色譜柱,。 流動相污染也可能是原因之一,。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移,。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動相成分,。 二、固定相穩(wěn)定性 固定相的穩(wěn)定性都是有限的,，即使在推薦的PH范圍內(nèi)使用,，固定相也會慢慢水解。例如,，硅膠基質(zhì)在pH4時水解穩(wěn)定性最好,。水解速度與流動相類型和 配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定,；長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定,；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。 經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解,。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水 解,，如氨基鍵合相等。 三,、色譜柱污染 保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染,。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì),。污染源可以是：流動相本身,，流動相容器，連接管,、泵,、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等,。通常通過實驗可判斷污染的來源,。 樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可 能是使保留時間漂移的潛在根源,。這些根源通常是樣品基質(zhì),。避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然,。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解,。使用保護(hù)柱是個非常有效的方法,。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。 四,、流動相組成 流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因,。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等。 五,、疏水坍塌 當(dāng)小孔徑,、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象,，這就是疏水坍塌,。此現(xiàn)象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動相浸潤固定相,，再用高水含量的流動相進(jìn)行平衡,。色譜柱長期儲存也會發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱（如Waters SymmetryShield RP色譜柱） 或非端基封口的色譜柱（如Waters Resolve色譜柱）也可避免發(fā)生坍塌,。 為何出現(xiàn)肩峰或分叉,？ ①樣品體積過大－－用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ； ②樣品溶劑過強(qiáng)－－采用較弱的樣品溶劑,； ③柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件,； ④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效－－更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品； ⑤進(jìn)樣器損壞－－更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子,。 為何出現(xiàn)鬼峰,？ ①進(jìn)樣閥殘余峰－－每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗； ②樣品中未知物－－處理樣品,； ③柱未平衡－－重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑（尤其是離子對色譜）,； ④三氟乙酸（TFA）氧化－－每天新配,用抗氧化劑 ,； ⑤水污染（反相）－－通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量,，用HPLC級的水 。 為何出現(xiàn)峰拖尾,？ ①柱超載－－降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相 ,； ②峰干擾－－清潔樣品,調(diào)整流動相； ③硅羥基作用－－加三乙胺,用堿致鈍化柱,增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,純化樣品 ,； ④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效－－更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品 ,； ⑤柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件； ⑥死體積或柱外體積過大－－連接點降至最低,對所有連接點作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管 ,； ⑦柱效下降－－用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱,。 除了流速外,，還有哪些因素能引起壓力改變？ 改變流動相組成和溫度,；改變柱長,、柱內(nèi)徑和填料粒度；柱突然阻塞壓力升高（正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的）,。 什么是強(qiáng)溶劑,、弱溶劑？ 改變流動相的組成或溶劑溶劑強(qiáng)度就可以改變峰容量因子和保留時間,。在一定條件下,，減少保留時間或縮短分析時間的溶劑為強(qiáng)溶劑，增加保留時間或延長分析時間的溶劑為弱溶劑,。 怎樣才會使峰位發(fā)生重排,？ 在分析多組分樣品時，僅改變流動相的強(qiáng)度（組成百分比）而不改變其組成,，一般僅僅改變所有組分的保留時間,，不會發(fā)生峰位的重排。 下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：流動相中換了強(qiáng)溶劑,；PH值的改變,；柱填料的改變；柱溫的改變,；流動相的組成改變（如加入離子對試劑三乙基胺等）,。
除了在線脫氣，常用的實驗室脫氣方式還有哪些,？ 加熱回流脫氣,，脫氣效果最佳，但無法保持,；氦脫氣,，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣,，但氦氣價格太貴,，所以用的不多；真空脫氣,，效果僅次于氦脫氣,，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失；超聲脫氣,，只能脫去約百分之三十的空氣,，但在實驗室中最常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣,，方便且效果好,。 評價一個色譜柱的最基本指標(biāo)有那些,？ 評價一根色譜柱的基本指標(biāo)是：塔板數(shù)、峰不對稱因子,、柱壓降,、適用范圍和鍵合相濃度以及峰容量。 為何出現(xiàn)峰展寬,？ ①樣品體積過大－－用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ,； ②在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展－－進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散 ； ③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢－－設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點 ,； ④檢測器時間常數(shù)過大－－設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10% ,； ⑤流動相粘度過高－－增加柱溫,采用低粘度流動相 ； ⑥檢測池體積過大－－用小體積池,卸下熱交換器 ,； ⑦保留時間過長－－等度洗脫時增加強(qiáng)溶劑含量,也可用梯度洗脫,； ⑧柱外體積過大－－將連接管徑和連接管長度降至最小,； ⑨樣品過載－－進(jìn)小濃度小體積樣品 ,。 （本文由實驗與分析編輯整理，轉(zhuǎn)載請注明出處）
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