土壤微生物檢測方法

物理農(nóng)業(yè)中的核心技術(shù)之一“土壤連作障礙電處理機(jī)”依賴的基礎(chǔ)研究內(nèi)容涉及到土壤微生物,、根結(jié)線蟲、氧化還原電位等的檢測,，其實(shí)驗(yàn)室檢測與實(shí)際生產(chǎn)的取樣檢測相結(jié)合,，并采取動態(tài)監(jiān)測方式，測定土壤微生物的發(fā)展動態(tài)和優(yōu)勢種群，進(jìn)而確定最佳的電處理的程序,。

土壤微生物計數(shù)法

土壤是最復(fù)雜,、最豐富的微生物基因庫，所含微生物不僅數(shù)量巨大,，而且各類繁多,，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌三大類,，是土壤最活躍的成分,。土壤微生物數(shù)量測定方法可分為三大類：一類是根據(jù)在培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)來計算土壤微生物的數(shù)量，統(tǒng)稱為培養(yǎng)計數(shù)法,，主要有稀釋平板法和最大或然計數(shù)法,；二類是將土壤微生物染色后，在顯微鏡下觀察計數(shù),，稱為直接鏡檢法,，包括涂片法、瓊脂薄片法和膜過濾法等,；三類是直接將微生物從土壤中分離和提取出來后再進(jìn)行測定,，主要有離心分離法。

1.1培養(yǎng)計數(shù)法

1.1.1概要

在自然條件下,，土壤中的大多數(shù)微生物處于休眠狀態(tài),，一旦供給可利用的碳源（如培養(yǎng)基），一些微生物將快速生長繁殖,。因此,，根據(jù)在培養(yǎng)基上所生長的微生物數(shù)量，可以估算土壤中微生物的數(shù)量,。這種土壤微生物數(shù)量測定方法稱為培養(yǎng)計數(shù)法,，主要包括稀釋平板計數(shù)法（簡稱稀釋平板法）和最大或然計數(shù)法。

稀釋平板計數(shù)法的基本原理：土壤微生物經(jīng)分散處理成為單個細(xì)胞后,，在特殊的培養(yǎng)基上生長并形成一個菌落,，根據(jù)形成的菌落數(shù)來計算微生物的數(shù)量。

最大或然計數(shù)法的基本原理：假設(shè)被測定的微生物在稀釋液中均勻分布,，并在試管或平板上全部存活,，隨著稀釋倍數(shù)的加大，稀釋液中微生物的數(shù)量將越來越少,，直到將某一稀釋度的土壤稀釋液接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)后,，沒有或很少出現(xiàn)微生物菌落。根據(jù)沒有出現(xiàn)菌落的最低稀釋度和出現(xiàn)菌落的最高稀釋度,，再用最大或然計數(shù)法計算出樣品中微生物的數(shù)量,。

1.1.2稀釋平板法

一,、試劑配制

常用的培養(yǎng)基各類很多，可根據(jù)需要測定的微生物種類選擇培養(yǎng)基,。按配方配制培養(yǎng)基后,，先在121℃下滅菌15min，冷卻至45～50℃使用,。凝固后的培養(yǎng)基可加熱溶解后使用,。

二、儀器設(shè)備

廣口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞,，移液管（1ml,、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮紙包好滅菌）培養(yǎng)皿（9㎝,，用牛皮紙包好后滅菌）和顯微鏡等。

三,、操作步驟

（1）土壤系列稀釋液制備

取新鮮土壤（＜2㎜）10.00g,，放入經(jīng)滅菌的裝有70ml水的廣口瓶中，塞上經(jīng)滅菌的橡皮塞,，在振蕩機(jī)上振蕩10min,，此為10^-1土壤稀釋液。迅速用滅菌的移液管吸取10^-1土壤稀釋液10ml,，放入滅菌的裝有90ml水的廣口瓶中,，塞上橡皮塞，混合均勻,，此為10^-2土壤稀釋液,。再如此依次配制10^-3、10^-4,、10^-5和10^-6系列土壤稀釋液,。上述操作均在無菌條件下進(jìn)行，以避免污染,。

（2）平板制備和培養(yǎng)

從兩個稀釋倍數(shù)的土壤稀釋液中（細(xì)菌和放線菌通常用10^-5和10^-6土壤稀釋液,，真菌用10^-2和10^-3稀釋液）吸取1.00ml（吸前搖勻），分別放入五套培養(yǎng)皿中（注意每變換一次濃度,，須更換一支移液管）,；再向培養(yǎng)皿內(nèi)注入45～50℃的培養(yǎng)基10ml，立即混合均勻,，靜置凝固后,，倒置放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌和放線菌在28℃下培養(yǎng)7～10d,，真菌在25℃下培養(yǎng)3～5d,。

（3）鏡檢計數(shù)

盡管使用不同的培養(yǎng)基，但細(xì)菌、放線菌和真菌都可能在同一個培養(yǎng)基上生長,，所以必須用顯微鏡做進(jìn)一步的觀察,。明顯有菌絲的一般是真菌，真菌的菌絲為絲狀分枝,，比較粗大,；而放線菌菌絲呈放射狀，比較細(xì),。細(xì)菌有球狀和桿狀,，有些細(xì)菌也形成細(xì)小的菌絲。酵母菌的菌落與細(xì)菌的菌落很相似,，但在顯微鏡下容易分辨,。酵母菌個體比較大，一般有圓形,、橢圓形,、卵形、檸檬形或黃瓜形,，有些還有瘤狀的芽,。

在兩級稀釋度中，選細(xì)菌和放線菌的菌落數(shù)為30～200個,、真菌菌落數(shù)為20～40個的培養(yǎng)皿各5個,，取其平均值計算出每組的菌落數(shù)。如果菌落很多,，可將其分成2～4等份進(jìn)行計數(shù),。微生物生物量可以通過微生物細(xì)胞個體大小和密度計算得到。

（4）計算

土壤微生物數(shù)量（cfu·g^-1）=MD/W

式中M為菌落平均數(shù)：D為稀釋倍數(shù),；W為土壤烘干質(zhì)量（g）,。

1.1.3最大或然計數(shù)法（MPN）

一、試劑配制

培養(yǎng)基配制與稀釋平板法基本相同,，采用試管培養(yǎng)時,，培養(yǎng)基中不需加瓊脂。

二,、食品設(shè)備

試管（2㎝×18㎝）,，其他同稀釋平板法。

三,、操作步驟

（1）土壤系列稀釋液中制備

按稀釋平板法制備土壤系列稀釋液,，一般配制10^-1～10^-6的稀釋液。

（2）接種和培養(yǎng)

從上述土壤系列稀釋液中各取1ml接種到平板培養(yǎng)基或試管液體培養(yǎng)基中,，每個稀釋度重復(fù)3～5次,，同時設(shè)置空白對照,，以檢驗(yàn)是否被污染。因微生物類型和生長速度不同,，所要求的稀釋倍數(shù),、培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間都有差別(表1-1)。根據(jù)微生物類型分別在28～30℃培養(yǎng)7～30d,。培養(yǎng)結(jié)束時,，記錄出現(xiàn)菌落的平板數(shù)量或出現(xiàn)特征反應(yīng)的試管數(shù)。

表1-1  幾種主要土壤微生物生理群MPN計數(shù)方法

   （3）計算

通常將有微生物生長的最后3個稀釋度中出現(xiàn)微生物菌落的平板數(shù)作為微生物生長指標(biāo),，從最大或然數(shù)表中查出最大或然數(shù)近似值,，按下列公式計算樣品中的微生物數(shù)量：

土壤微生物數(shù)量（cfu·g^-1）=MD/W

式中M為最大或然數(shù)近似值；D為全部出現(xiàn)菌落的最高稀釋倍數(shù),；W為土壤烘干質(zhì)量（g）,。

例如，某土壤系列稀釋液1ml接種到5個平板,，經(jīng)培養(yǎng)后,，10^-3～10^-5的稀釋液全部出現(xiàn)菌落；接種10^-6稀釋液的5個平板只有4個出現(xiàn)菌落,；接種10^-7稀釋液的只有1個出現(xiàn)菌落,；接種10^-8稀釋液的全部沒有菌落,。由此得到土壤的微生物生長指標(biāo)為541,，查最大或然數(shù)表（見附錄三，表三）得到其最大或然數(shù)近似值為17,，乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)10⁵,，再除以土壤烘干質(zhì)量即可得到土壤微生物數(shù)量。

微生物生長的數(shù)量指標(biāo)都應(yīng)當(dāng)是三位數(shù),。但是不管重復(fù)數(shù)多少,，第一位數(shù)字如重復(fù)數(shù)相等，即代表全部重復(fù)都出現(xiàn)菌落的最高稀釋倍數(shù)的數(shù)值,。后兩位數(shù)字依次是以下兩個稀釋度出現(xiàn)菌落的平板數(shù)量,。如果以下稀釋液還出現(xiàn)了微生物菌落，則將其出現(xiàn)微生物菌落的重復(fù)數(shù)加到第三位數(shù)上,。例如,，10^-3～10^-8系列稀釋液（4個重復(fù)）出現(xiàn)菌落的平板數(shù)分別為4，4,，3,，2，1和0.這里10^-7稀釋液出現(xiàn)菌落的平板數(shù)為1,，將其加到前一稀釋液（10^-6）的平板數(shù)上,，即得該土壤的微生物生長指標(biāo)為433,，查表得最大或然數(shù)近似值為30，計算得到每克土壤（新鮮重）的微生物數(shù)量為3.0×10⁵,。

應(yīng)注意：如果出現(xiàn)微生物生長的稀釋度比沒有出現(xiàn)微生物生長的稀釋倍數(shù)低,，則說明微生物在稀釋液中不是均勻分布的，在這種情況下就需要對實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行核查,。

1.1.4方法評論

最初研究土壤微生物的方法是培養(yǎng)計數(shù)法,，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可測定土壤中可培養(yǎng)的、不同類型的微生物數(shù)量,，包括細(xì)菌,、真菌和放線菌，特別是可用于測定可培養(yǎng)的,、具有特殊功能的微生物種群,，如氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌,、反硝化細(xì)菌,、解磷菌和固氮菌等。該方法存在的問題是,，僅能測定在培養(yǎng)基上迅速生長繁殖,，并能夠形成菌落或有某種特征的土壤微生物種群，而大部分土壤微生物種群不能在培養(yǎng)基上生長,。另外,，在培養(yǎng)基上所形成的菌落可能來自多個細(xì)胞，也有可能由菌絲（或多個細(xì)胞）發(fā)育成菌落,。因此,，培養(yǎng)計數(shù)法所測定的微生物數(shù)量，通常不到土壤中微生物實(shí)際數(shù)量的1%,，故不能作為土壤微生物的真實(shí)數(shù)量,。此外，該方法即使用于測定土壤中可培養(yǎng)的微生物數(shù)量,，測定結(jié)果的精確度和重復(fù)性較差,。

1.2直接鏡檢計數(shù)法

1.2.1概要

由于土壤微生物的特性和培養(yǎng)基的局限性，通過在培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)量來間接地計算土壤微生物數(shù)量,，一般只能測量出土壤中很少的一部分微生物,。因此，一些研究者提出了直接鏡檢計數(shù)法,，主要包括涂片法,、瓊脂薄片法和膜過濾法。使用一般的染色劑進(jìn)行涂片染色,，鏡檢時很難區(qū)別死的微生物細(xì)胞和土壤顆粒,，這里僅介紹FDA染色涂片測定活菌絲數(shù)和FITC染色測定活細(xì)菌數(shù)的方法,。

涂片法的基本原理：將一定量的土壤懸浮液涂抹在載玻片上，風(fēng)干染色后進(jìn)行鏡檢計數(shù),，從而計算出單位質(zhì)量土壤的微生物數(shù)量,。由于使用特別的染色劑可著色活細(xì)胞，從而可測定土壤活體微生物數(shù)量,。

瓊脂薄片法的基本原理：在制備土壤懸浮液時加入一定量瓊脂,，在進(jìn)行土壤分散的同時進(jìn)行加熱，取一定量的土壤-瓊脂懸浮液制成瓊脂薄片,，染色后進(jìn)行鏡檢計數(shù),，再計算出單位質(zhì)量土壤的微生物數(shù)量。

膜過濾的基本原理：將土壤懸浮液用無菌水稀釋,，取一定量的稀釋液染色后,，用微孔膜過濾，對微孔膜上的微生物進(jìn)行鏡檢計數(shù),，再計算出單位質(zhì)量土壤的微生物數(shù)量,。

1.2.2 FDA染色涂片法測定活菌絲數(shù)

一、試劑配制

磷酸鹽緩沖液（0.06mol·L^-1）：8.28 g  溶于1L去離子水,，10.68g  溶于1L去離子水,；將兩種溶液按28﹕72的比例混合，調(diào)節(jié)pH值使其與土壤pH值大致相同,。

FDA染色液：

瓊脂溶液（1.5%）：1.5g瓊脂溶于100ml磷酸鹽緩沖液中（pH7.6）,。

二、儀器設(shè)備

三角瓶（200ml）,，試管（15ml）,，振蕩機(jī),，載玻片（圖1-1）,，蓋玻片，熒光顯微鏡等,。

圖1-1 染色-鏡檢法涂片

外圓面積1cm²,，半徑5.64㎜，內(nèi)圓半徑3.64㎜,，鏡檢必須在外圓邊緣約1.7㎜以內(nèi)的區(qū)域進(jìn)行

三,、操作步驟

（1）土壤分散

取10.00g新鮮土壤（＜2㎜）于200ml三角瓶中，加入95 ml 0.06 mol·L^-1磷酸鹽緩沖溶液,，充分振蕩15 min,。

（2）染色

取1 ml 土壤懸浮液于15 ml的試管中，加入4 ml 磷酸鹽緩沖溶液,，再加入1 ml FDA染色液,。室溫下培養(yǎng)3 min 后,，加入1 ml 瓊脂溶液，混勻,。

（3）涂片和鏡檢

取0.1 ml 上述土壤-染色液-瓊脂混合液均勻地涂于如圖1-1所求的載玻片上,，蓋上蓋玻片，迅速用熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢計數(shù),。鏡檢計數(shù)方法見下文的瓊脂薄片法,。

（4）計算

土壤活菌絲的生物體積及生物量碳計算方法同瓊脂薄片法。

1.2.3  FITC染色涂片法測定活細(xì)菌數(shù)

一,、試劑配制

Tris-鹽酸溶液I ：6.35 g 三羥基氨基甲烷溶于800 ml 去離子水,，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.5，定溶至 1 L,。

Tris-鹽酸溶液II ：25.4 g 三羥基氨基甲烷溶于800 ml 去離子水,，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.5，定溶至 1 L,。

INT溶液：2 g 氯化2-（p-碘苯基-3-p-硝基苯 ）-5-苯四氮唑溶于1 L Tris-鹽酸溶液II中,。

NADH-NADPH混合溶液：0.4 g NADH和0.4 g NADPH溶于100 ml Tris-鹽酸溶液II中。

FITC染色液：

碳酸鹽-重碳酸鹽緩沖液（0.5 mol·L^-1）：42 g 溶于1 L去離子水,；53 g 溶于1 L 去離子水,。吸取80 ml 和100 ml 溶液混合，加去離子水500 ml并調(diào)節(jié)pH值至9.6,，定容至1 L,。

焦磷酸鈉溶液（5%， ）：8.39 g 焦磷酸鈉（）溶于100 ml去離子水,。

碳酸鈉溶液 ：10.6 g 碳酸鈉溶于100 ml去離子水,。

甘油溶液：量取45 ml 甘油于5 ml 1 mol·L^-1碳酸鈉溶液中，搖勻,。

磷酸鹽緩沖液（0.01 mol·L^-1,pH 7.2）：1.38 g 溶于1 L去離子水中,，1.78 g 溶于1 L去離子水，將兩種溶液按28﹕72的比例混合,。

氯化鈉溶液 ：8.77 g 氯化鈉溶于1 L去離子水,。

甲醛溶液：20 ml 甲醛溶于80 ml去離子水。

二,、儀器設(shè)備

燒杯（100 ml）,，攪拌機(jī)，閃爍計數(shù)瓶,，超聲波水浴器,，載玻片（圖1-1），蓋玻片，熒光顯微鏡等,。

三,、操作步驟

（1）土壤分散

取1.00 g 新鮮土壤（＜2㎜）于100 ml燒杯中，加入20 ml Tris-鹽酸溶液I,，用攪拌機(jī)低速攪拌1 min,。

（2）培養(yǎng)

取2.0 ml上述土壤懸浮液于閃爍計數(shù)瓶中，加入1 ml INT溶液,，再加入1 ml NADHNADPH混合溶液,，在25℃的黑暗條件下培養(yǎng)4 h。再加入1 ml 20%甲醛水溶液,，4℃過夜,。

（3）涂片和染色

將上述裝有經(jīng)培養(yǎng)的土壤懸浮液的閃爍計數(shù)瓶置于超聲波水溶器中，低能量（輸出功率50W）超聲波處理2 min,，加入瓊脂使其濃度達(dá)到0.01%（ V/V）,。取0.01 ml混合液均勻地涂沫于如圖1-1所示的載玻片上（使用前用稀酸洗滌），于酒精燈上加熱干燥后用FITC染色液染色3 min,。染色后置于0.5 mol·L^-1碳酸鹽-重碳酸鹽緩沖液中浸泡10 min,，再轉(zhuǎn)入5%焦磷酸鈉溶液中浸泡2 min，取出用去離子水輕輕沖洗,。

（4）鏡檢

洗滌后染色片干燥后,，加一滴甘油溶液，蓋上蓋玻片固定,，用熒光顯微鏡進(jìn)行鏡進(jìn)行鏡檢計數(shù),，具體方法參見瓊脂薄片法。

（5）計算

土壤活細(xì)菌的生物體積和生物量碳的計算方法參見瓊脂薄片法,。

1.2.4瓊脂薄片法

一,、試劑配制

瓊脂-Decon 90溶液：1g瓊脂溶于100ml無菌水（過0.20um濾膜），加熱溶解,，再與20ml Decon 90稀釋液（12ml Decon 90于100ml無菌水）混合均勻,。

臺酚藍(lán)溶液：5g 苯酚溶于100 ml無菌水，1g臺酚藍(lán)溶于100 ml無菌水,；按照15﹕1的比例混合,；再按4﹕1與冰醋酸混合,，用0.2um膜過濾,。

二、儀器設(shè)備

可控溫超聲波水浴清洗機(jī)（300 Ultrasonik NEY）,，可調(diào)慢速攪拌機(jī)（1.5V,，0～2000rev·min^-1，Kanke and Kunkel EKA-labortechnik）,，顯微鏡,，顯相器（Camera lucida）,，血球計數(shù)板（圖1-2），蓋玻片（厚0.47㎜）,，加拿大香脂（Canada Balsam）,。

圖1-2   血球計數(shù)板（改進(jìn)型）

    三、操作步驟

（1）土壤分散

取1.00～2.00g（根據(jù)土壤微生物含量而定）＜2㎜的新鮮土壤于100 ml塑料杯中,，加入60 ml 60℃的瓊脂-Decon 90混合溶液,。將塑料杯置于超聲波清洗機(jī)水槽中（土壤瓊脂混合溶液的液面要低于水面），最大功率處理15 min,。在超聲波處理過程中,，保持水浴60℃，并不斷慢速攪拌土壤瓊脂懸浮液,。處理結(jié)束后仍繼續(xù)攪拌土壤懸浮液,，直到取樣前30 s停止。取樣必須在10 min內(nèi)完成,。

（2）瓊脂薄片制備

將吸管（內(nèi)徑1㎜）插入土壤-瓊脂懸浮液液面下1㎝處,，吸取約0.02 ml懸浮液，迅速放入血球計數(shù)板上,，立即蓋上蓋玻片（厚0.47㎜）,，冷卻凝固后一起放入去離子水（用前經(jīng)0.2 濾膜過濾）中，使瓊脂薄片分離,。每個樣品至少做4個瓊脂薄片,，即4次重復(fù)。

（3）染色

將瓊脂薄片放到普通玻片上,，干燥后浸泡在臺酚藍(lán)溶液中,。1h后先用無菌水沖洗，再用95%酒精脫水,。在瓊脂薄片上加一滴加拿大香脂,，蓋上普通的蓋玻片，即得瓊脂薄片,，可永久保存,。

（4）鏡檢

將瓊脂薄片置于顯微鏡下，在目鏡上放入New Porton G12分格計數(shù)板,，根據(jù)表1-2進(jìn)行鏡檢,。僅對被染為深藍(lán)色的球形和圓柱形微生物計數(shù)，形狀不規(guī)則（如破裂開）和其他顏色（如黃色,、紫紅色）的物體均不計數(shù),。

球形微生物分為11級（表1-2），直徑在0.34～0.97 的為第1組，計數(shù)面積為2.0×10² （相應(yīng)于New Porton G12分格玻璃片左上角的兩個方格）,。直徑在0.97～3.13 的為第2組,，計數(shù)面積為2.1×10³ （相應(yīng)于New Porton G12分格玻璃片的全部方格），第1組和第2組在油鏡下鏡檢,。直徑在3.13～16.00 的為第3組,，在500倍下鏡檢，計數(shù)面積為3.7×10⁴ （相應(yīng)于目鏡分格玻璃片的A方格面積）,。圓柱形微生物可分為8級,，均在500倍下進(jìn)行鏡檢，計數(shù)面積同球形微生物的第3組,。圓柱形微生物的直徑用New Porton G12分格玻璃片直接測量,，而長度則通過顯相器直接描繪在A4紙上，再用測繪輪測定其長度,，也可用其他的方法如網(wǎng)格交叉的方法來測定,。每一組必須在不同部位鏡檢20次。如果20次所測定的微生物個數(shù)低于40,，則必須加測20次,。

表1-2  直接顯微鏡檢的視野和放大倍數(shù)

（5）計算

根據(jù)鏡檢所測定的微生物數(shù)量及所計數(shù)的面積計算微生物生物體積，再按其密度（1.1g· ）,、干物質(zhì)含量（25%）和含碳量（47%）估計微生物生物量碳,。