微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計數(shù),。
當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時,，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗,，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外,，本法不適用于活菌制劑的檢查,。
微生物計數(shù)試驗環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,，防止再污染,，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域,、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測,。
如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和,。供試品檢查時,，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對微生物無毒性,。
供試液制備時如果使用了表面活性劑,，應(yīng)確認(rèn)其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性,。
計數(shù)方法
計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method,，簡稱MPN法,。MPN法用于微生物計數(shù)時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品,，MPN法可能是更適合的方法,。
供試品檢查時，應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計數(shù)方法,，檢測的樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定,。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。
計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計數(shù)方法適用性試驗
供試品微生物計數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查,。
供試品微生物計數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗,，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計數(shù)。
若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時,，計數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗,。
菌種及菌液制備
菌種 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存,，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性,。計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)方法適用性試驗用菌株見表1。
菌液制備 按表1規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗菌株,。取金黃色葡萄球菌,、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌,、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物,，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液,，將孢子洗脫,。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液,。
菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用,；若保存在2～8℃,，可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃,，在驗證過的貯存期內(nèi)使用,。
陰性對照
為確認(rèn)試驗條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長,。如陰性對照有菌生長,，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。
培養(yǎng)基適用性檢查
微生物計數(shù)用的成品培養(yǎng)基,、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查,。
按表1規(guī)定，接種不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板,，置表1規(guī)定條件下培養(yǎng),。每一試驗菌株平行制備2 管或2 個平皿。同時,，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗,。
被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致,；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng)基管比較,，試驗菌應(yīng)生長良好。
計數(shù)方法適用性試驗
1.供試液制備
根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,，采取適宜的方法制備供試液,。供試液制備若需加溫時，應(yīng)均勻加熱,，且溫度不應(yīng)超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基,，不得超過1小時,。
常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用,，應(yīng)建立其他適宜的方法,。
（1）水溶性供試品 取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,，或pH7.2磷酸鹽緩沖液,，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1：10供試液。若需要,，調(diào)節(jié)供試液pH值至6～8,。必要時，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋,。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液,。
（2）水不溶性非油脂類供試品 取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,，或pH7.2磷酸鹽緩沖液,，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1：10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80,，使供試品分散均勻,。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6～8,。必要時,，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。
（3）油脂類供試品 取供試品,，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解,，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40℃（特殊情況下,，最多不超過45℃）,，小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行,，然后加入預(yù)熱的稀釋液使成1：10供試液,，保溫，混合,，并在最短時間內(nèi)形成乳狀液,。必要時，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋,。
（4）需用特殊方法制備供試液的供試品
膜劑供試品 取供試品,，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,，或pH7.2磷酸鹽緩沖液,，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，浸泡,，振搖,，制成1：10的供試液。若需要,，調(diào)節(jié)供試液pH值至6～8,。必要時，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋,。
腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品,，加入pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑），置45℃水浴中,，振搖,，使溶解，制成1：10的供試液,。必要時,，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋,。
氣霧劑、噴霧劑供試品 取供試品,，置-20℃或其他適宜溫度冷凍約1小時,，取出，迅速消毒供試品開啟部位,，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔,，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動容器,，使拋射劑緩緩全部釋出,。供試品亦可采用其他適宜的方法取出。用無菌注射器從每一容器中吸出藥液于無菌容器中混合,，然后取樣檢查,。
貼膏劑供試品 取供試品，去掉防粘層,，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑料器皿上,，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布），避免貼膏劑粘貼在一起,。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）稀釋液的容器中,，振蕩至少30分鐘。必要時,，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋,。
2.接種和稀釋
按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供試液,。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%,。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級的供試液進(jìn)行計數(shù)方法適用性試驗,。
（1）試驗組 取上述制備好的供試液，加入試驗菌液,，混勻,，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。
（2）供試品對照組 取制備好的供試液,，以稀釋液代替菌液同試驗組操作,。
（3）菌液對照組 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進(jìn)行微生物回收試驗,。
若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級的供試液進(jìn)行方法適用性試驗時,，應(yīng)采用適宜的方法對供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除,，供試液可經(jīng)過中和,、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗,。
3.抗菌活性的去除或滅活
供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計數(shù),。若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌落數(shù)值的50%,，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。
（1）增加稀釋液或培養(yǎng)基體積,。
（2）加入適宜的中和劑或滅活劑,。
中和劑或滅活劑（表2）可用于消除干擾物的抑菌活性，最好在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入若使用中和劑或滅活劑,，試驗中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對照組,，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗組操作，以確認(rèn)其有效性和對微生物無毒性,。中和劑或滅活劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi),。
表2 常見干擾物的中和劑或滅活方法
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干擾物 可選用的中和劑或滅活方法
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戊二醛、汞制劑 亞硫酸氫鈉
酚類,、乙醇,、醛類、吸附物 稀釋法
醛類 甘氨酸
季銨化合物,、對羥基苯甲酸,、雙胍類化合物 卵磷脂
季銨化合物、碘 ,、對羥基苯甲酸 聚山梨酯
水銀 巰基醋酸鹽
水銀 ,、汞化物、醛類 硫代硫酸鹽
EDTA ,、喹喏酮類抗生素 鎂或鈣離子
磺胺類 對氨基苯甲酸
β內(nèi)酰胺類抗生素 β內(nèi)酰胺酶
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（3）采用薄膜過濾法,。
（4）上述幾種方法的聯(lián)合使用。
若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法,，對特定試驗菌回收的失敗,，表明供試品對該試驗菌具有較強(qiáng)抗菌活性，同時也表明供試品不易被該類微生物污染,。但是,，供試品也可能僅對特定試驗菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用,。因此,，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下,，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進(jìn)行計數(shù)方法適用性試驗,。若方法適用性試驗符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進(jìn)行供試品檢查,。
4.供試品中微生物的回收
表1所列的計數(shù)方法適用性試驗用的各試驗菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗,。微生物的回收可采用平皿法,、薄膜過濾法或MPN法。
（1）平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法,。表1中每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿,，以算術(shù)均值作為計數(shù)結(jié)果。
傾注法 取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液1ml置直徑90mm的無菌平皿中,，注入15～20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,，混勻，凝固,，倒置培養(yǎng),。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加,。按表1規(guī)定條件培養(yǎng),、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù),。計算各試驗組的平均菌落數(shù),。
涂布法 取15～20ml溫度不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基注入直徑90mm的無菌平皿，凝固,，制成平板,，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿,，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加,。每一平板表面接種上述照“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng),、計數(shù),。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù),。
（2）薄膜過濾法 薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm,，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜,，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整,。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌,。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性,。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜,。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥,。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面,。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜,，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml,。總沖洗量不得超過1000ml,，以避免濾膜上的微生物受損傷,。
取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2的供試品,，若供試品中所含的菌數(shù)較多時,，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,，混勻,，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜,。
若測定需氧菌總數(shù),，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測定霉菌和酵母總數(shù),，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上,。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù),。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜,。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。
（3）MPN法 MPN法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過濾法和平皿計數(shù)法,，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用,，本法不適用于霉菌計數(shù)。若使用MPN法,，按下列步驟進(jìn)行,。
取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液至少3個連續(xù)稀釋級，每一稀釋級取3份1ml分別接種至3管裝有9～10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,，同法測定菌液對照組菌數(shù),。必要時可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑,。
接種管置30～35℃培養(yǎng)3天,，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷,，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,，在相同條件下培養(yǎng)1～2天，觀察是否有微生物生長,。根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表3査被測供試品每1g或每1ml中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù),。
表3 微生物最可能數(shù)檢索表
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生長管數(shù) 需氧菌總數(shù) 95%置信限
最可能數(shù)
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每管含樣品的g或ml數(shù) MPN/g或ml 下限 上限
---------------------
0.1 0.01 0.001
---------------------------------------------------------
0 0 0 <3 0 9.4
0 0 1 3 0.1 9.5
0 1 0 3 0.1 10
0 1 1 6.1 1.2 17
0 2 0 6.2 1.2 17
0 3 0 9.4 3.5 35
1 0 0 3.6 0.2 17
1 0 1 7.2 1.2 17
1 0 2 11 4 35
1 1 0 7.4 1.3 20
1 1 1 11 4 35
1 2 0 11 4 35
1 2 1 15 5 38
1 3 0 16 5 38
2 0 0 9.2 1.5 35
2 0 1 14 4 35
2 0 2 20 5 38
2 1 0 15 4 38
2 1 1 20 5 38
2 1 2 27 9 94
2 2 0 21 5 40
2 2 1 28 9 94
2 2 2 35 9 94
2 3 0 29 9 94
2 3 1 36 9 94
3 0 0 23 5 94
3 0 1 38 9 104
3 0 2 64 16 181
3 1 0 43 9 181
3 1 1 75 17 199
3 1 2 120 30 360
3 1 3 160 30 380
3 2 0 93 18 360
3 2 1 150 30 380
3 2 2 210 30 400
3 2 3 290 90 990
3 3 0 240 40 990
3 3 1 460 90 1980
3 3 2 1100 200 4000
3 3 3 >1100
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注：表內(nèi)所列檢驗量如改用1g（或ml）,、0.1g（或ml）和0.01g（或ml）時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍,；如改用0.01g（或ml）,、0.001g（或ml）和0.0001g（或ml）時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10倍,，其余類推,。
5.結(jié)果判斷
計數(shù)方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法時,，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi),；采用MPN法時，試驗組菌數(shù)應(yīng)在菌液對照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi),。若各試驗菌的回收試驗均符合要求,，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù),。
方法適用性確認(rèn)時,，若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達(dá)不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進(jìn)行供試品的檢查,。
供試品檢查
檢驗量
檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g,、ml或cm2）。
一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個最小包裝的供試品,，混合,，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗。
除另有規(guī)定外,，一般供試品的檢驗量為10g或10ml,；膜劑為100cm2；貴重藥品,、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減,。檢驗時，應(yīng)從2個以上最小包裝單位中抽取供試品,，大蜜丸還不得少于4丸,，膜劑還不得少于4片。
供試品的檢查
按計數(shù)方法適用性試驗確認(rèn)的計數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù),、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定,。
胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù),。
陰性對照試驗 以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對照試驗,，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查,。
1.平皿法
平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外,，取規(guī)定量供試品,，按方法適用性試驗確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測定，每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板,。
培養(yǎng)和計數(shù) 除另有規(guī)定外,，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在30～35℃培養(yǎng)3～5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在20～25℃培養(yǎng)5～7天,，觀察菌落生長情況,，點計平板上生長的所有菌落數(shù)，計數(shù)并報告,。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù),。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù),，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù),。若同稀釋級兩個平板的菌落數(shù)平均值不小于15， 則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上,。
菌數(shù)報告規(guī)則 需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級,、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告的依據(jù),。取最高的平均菌落數(shù),，計算1g、1ml或10cm2供試品中所含的微生物數(shù),，取兩位有效數(shù)字報告,。 |
如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,，但平均菌落數(shù)小于1 時,，以<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。
2.薄膜過濾法
除另有規(guī)定外,，按計數(shù)方法適用性試驗確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備,。取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2供試品的供試液,，若供試品所含的菌數(shù)較多時,，可取適宜稀釋級的供試液，照方法適用性試驗確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中,，立即過濾,，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng),。
培養(yǎng)和計數(shù) 培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法,，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。
菌數(shù)報告規(guī)則 以相當(dāng)于1g,、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù),；若濾膜上無菌落生長，以<1報告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g,、1ml或10cm2供試品）,，或<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。
3.MPN法
取規(guī)定量供試品,，按方法適用性試驗確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種,，所有試驗管在30～35℃培養(yǎng)3～5天，如果需要確認(rèn)是否有微生物生長,，按方法適用性試驗確定的方法進(jìn)行,。記錄每一稀釋級微生物生長的管數(shù)，從表3查每1g或1ml供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù),。
結(jié)果判斷
需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）,；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求,，可使用含抗生素（如氯霉素,、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。使用選擇性培養(yǎng)基時,，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查,。若采用MPN法，測定結(jié)果為需氧菌總數(shù),。
各品種項下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：
l01cfu：可接受的最大菌數(shù)為20,；
102cfu：可接受的最大菌數(shù)為200；
103cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000,，依此類推,。
若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項下的規(guī)定,，判供試品符合規(guī)定,；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定,。
稀釋液,、沖洗液及培養(yǎng)基
見非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106）。
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