最新回復(fù)

• 大仙 (2011-8-21 12:43:37)

  請(qǐng)問樓主：
  你買了多少量的試劑盒,，摸條件是否順利，real time 到底好做嗎,？
  我一同學(xué)做real time 光摸條件就用去了100多次的試劑,，試劑這么貴，呵呵,，請(qǐng)多多指教,。

• 大仙 (2011-8-21 12:44:09)

  我之前買了一個(gè)50次的試劑盒，做了兩次曲線不漂亮就不做了,，后來?yè)Q了寶生物的,，總共做了四個(gè)基因，一個(gè)內(nèi)參,，三個(gè)目的基因,，200次就夠了，所以有時(shí)試劑不好,，你做多少次都很難調(diào)得好的,。real-time做的好的話，結(jié)果比半定量的可靠得多,，從結(jié)果可以看出不少內(nèi)參到了20個(gè)循環(huán)就進(jìn)入平臺(tái)期,，我們平時(shí)做半定量的時(shí)候都是用30個(gè)循環(huán)去做，所以結(jié)果差別很大,。

• 大仙 (2011-8-21 12:45:47)

  盡管有些地方值得商榷,，但鼓勵(lì)大家分享心得。

• 大仙 (2011-8-21 12:46:20)

  終于把實(shí)驗(yàn)做完了,，做的是相對(duì)定量法,。想把自己做定量PCR寫下來，和大家一起分享學(xué)習(xí)。
  1,、首先要確定引物的溶解曲線,，最好的是一個(gè)峰，而且TM值在80度以上,，有人說太低可能是D二聚體,，但我做過82度的也有D二聚體，所以一定要把產(chǎn)物跑電泳才能確定引物的特異性,。
  
  產(chǎn)物的Tm并不規(guī)定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的範(fàn)圍,，但儘量在80以上，主要還是要結(jié)合電泳結(jié)果來看,。我做過Tm 79度的,。
  
  2、配引物一定要在無菌操作臺(tái)里,，因?yàn)槎縋CR要求比較高,，一點(diǎn)污染都會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,，我就試過引物污染,，陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。
  恩,，磨刀不誤砍柴工,。支持！
  
  3,、確定引物后要確定模板的濃度,，我覺得說明書說的都不準(zhǔn)，最好是自己調(diào),，把內(nèi)參和目的基因的CT值調(diào)到8到26之間,，最低不超過30，太高難以分辨,，太低出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,，低的情況溶解曲線也變成多個(gè)峰。
  
  這個(gè),，Ct在8肯定是不準(zhǔn)的,。ABI儀器自動(dòng)生成閾值的計(jì)算方法是Ct 8-16。大的不要超過35最好,，不過我做過Ct 38,，電泳產(chǎn)物大小是正確的，數(shù)值也拿來用了,。哎,。
  
  4、要做陰性對(duì)照，有人說陰性對(duì)照是不加引物,，有人說是不加模板,，我覺得是后者比較好一點(diǎn)。
  
  陰性對(duì)照不加引物還是頭一次聽說,。
  
  5,、一定要把PCR后的產(chǎn)物跑電泳，因?yàn)槟銠C(jī)子分辨不了你的產(chǎn)物的大小,。我試過溶解曲線很漂亮,，但跑出來電泳多條帶。
  同感,，我也遭遇過,。很令人鬱悶、費(fèi)解,。
  
  6,、有條件就做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
  
  這個(gè)主要是看選擇什麼方法處理數(shù)據(jù),。
  
  7,、好的試劑和引物對(duì)你的實(shí)驗(yàn)幫助大，假如做3次曲線不漂亮,，建議換引物或者試劑,，定量PCR的引物設(shè)計(jì)要求比普通PCR的高，建議讓專業(yè)設(shè)計(jì),，我的是在寶生物設(shè)計(jì)的,，不錯(cuò)。
  
  定量引物和普通引物設(shè)計(jì)上各有側(cè)重,，不能籠統(tǒng)的說要求孰高孰低哈,，沒有最好的，只有最適合的,，哈哈,。
  
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