10×擴增緩沖液 　   10 ul

4種dNTP混合物 　 各200 umol/L

引物 　　　　 　     各10～100 pmol

模板DNA 　　　 　0.1～2 ug

Taq DNA聚合酶 　  2.5 u

Mg²⁺　　　　　　 1.5 mmol/L

加雙或三蒸水至 　  100 ul

二、PCR引物設計

PCR反應中有兩條引物,，即5′端引物和3′引物,。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同,；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補,。

1.   引物設計的基本原則

（1）  引物長度：15-30 bp，常用為20 bp左右,。

（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC最好隨機分布,，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

（3） 引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列,。

（4）兩個引物之間不應存在互補序列,，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

（5） 引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列,，否則易導致非特異性擴增。

（6）引物3‘端的堿基,，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C,。

（7） 引物的5 ′端可以修飾,。如附加限制酶位點，引入突變位點,，用生物素,、熒光物質(zhì),、地高辛標記，加入其它短序列,，包括起始密碼子,、終止密碼子等。

2.   引物設計軟件

Primer Premier5.0 （自動搜索）*,、Oligo6 （引物評價）,、Vector NTI Suit、DNAsis,、Omiga,、DNAstar、Primer3 （在線服務）,。

三,、模板的制備

（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA,。

（2）模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象,，可以是病原體標本如病毒、細菌,、真菌等,。也可以是病理生理標本如細胞,、血液,、羊水細胞等。法醫(yī)學標本有血斑,、精斑,、毛發(fā)等。

（3）標本處理的基本要求是除去雜質(zhì),，并部分純化標本中的核酸,。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌,，可用溶菌酶加EDTA處理,。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚,、氯仿抽提純化,，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板。

四,、PCR反應條件的控制

1.  PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 ,。 

2.  鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L,。

　　
3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,，20～200 umol/L,。

　
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。

　　
5.  引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L,。

　
6.  反應溫度

（1）變性溫度和時間95℃,，30 s。

（2）退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右,，一般在45～55℃,。

（3）延伸溫度和時間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）,。

（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7.  循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次,。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低,，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量,。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右,，循環(huán)數(shù)超過30個以后,，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”,。

五、PCR的循環(huán)參數(shù)
 
1.  預變性（Initial denaturation）

模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關重要,，建議加熱時間參考試劑說明書,，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

2.  循環(huán)中的變性步驟

循環(huán)中一般95℃,，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性,，可能的情況下可 縮短該步驟時間，變性時間過長損害酶活性,，過短靶序列變性不徹底,，易造成擴增失敗。

3.  引物退火（Primer annealing）

退火溫度需要從多方面去決定,，一般根據(jù)引物的Tm值為參考,，根據(jù)擴增的長度適當下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估,。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響,。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,，本步驟可省略

延伸時間隨擴增片段長短而定,，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1 min/kbp,。

5.  循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-40循環(huán),，過多易產(chǎn)生非特異擴增,。

6.  最后延伸

在最后一個循環(huán)后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全,，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈,。

六、PCR步驟
 
1.  DNA變性

（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,， 氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA。

2.  退火

（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低,，引物與DNA模板結合,，形成局部雙鏈。

3.  延伸

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右,，活性最佳）的作用下,，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸,，合成與模板互補的DNA鏈,。

七、PCR檢測
 
PCR反應擴增出了高的拷貝數(shù),，下一步檢測就成了關鍵,。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段,。電泳法檢測特異性是不太高的,，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行,，成為了主流檢測方法,。近年來以熒光探針為代表的檢測方法,，有逐漸取代電泳法的趨勢,。

1.  由于PCR反應靈敏度很高，因此要特別主意防止DNA污染的發(fā)生,。樣品間的相互污染可能產(chǎn)生假陽性結果,，特別是將PCR技術應用到臨床病原菌感染確定中。

1.  假陰性,，不出現(xiàn)擴增條帶

（1）模板原因

①  模板中含有雜蛋白質(zhì)。

②  模板中含有Taq酶抑制劑,。

③  模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈,，特別是染色體中的組蛋白。

④  在提取制備模板時丟失過多,，或吸入酚,。

⑤  模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時,，不出現(xiàn)擴增帶,，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病,，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應固定不宜隨意更改,。

（2）酶失活

①  需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用,，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性,。

②  忘加Taq酶或溴乙錠。

（3）引物

①  引物質(zhì)量,。

②  引物的濃度,。

③  兩條引物的濃度是否對稱。

解決對策：

①  選定一個好的引物合成單 位,。

②  引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn),，而且兩引物帶的亮度應大體一致,，如一條引物有條帶，一條引物無條帶,，此時做PCR有可能失敗,，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,，一條亮度低,，在稀釋引物時要平衡其濃度。

③  引物應高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,，導致引物變質(zhì)降解失效。

④  引物設計不合理,，如引物長度不夠,，引物之間形成二聚體等。

（4）Mg²⁺濃度

①  濃度過高降低PCR擴增的特異性,。

②  濃度過低影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶,。

（5）反應體積的改變

①  通常進行PCR擴增采用的體積為20 ul、30 ul,、50 ul或100 ul,，應用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定;

②  在做小體積如20 ul 后,，再做大體積時，一定要模索條件,，否則容易失敗,。

（6）物理原因
 
①  變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低,，變性時間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性,。

②  退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率,；退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率,。

③  擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度有問題,。

（7）靶序列變異

①  靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結合。

②  靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,。