分光光度計
分光光度計已經成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸,，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量,。核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,，單鏈、雙鏈DNA,，以及RNA,。核酸在波長 260 nm處有最高吸收峰。吸收紫外光的性質是嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)所具有的,，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質,，不論是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性,。但紫外法不能區(qū)分DNA和RNA,，只能用來鑒定核酸的純度和含量。
蛋白質由于含有芳香氨基酸,，因此也能吸收紫外光,。通常蛋白質的吸收高峰在280nm波長處，在260nm處的吸收值公為核酸的十分之一或更低,，故核酸樣品中蛋白質含量較低時對核酸的紫外測定影響不大,。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm與280nm吸收的比值則在1.9左右,。當樣品中蛋白質含量較高時比值即下降,。
分光光度計采用一個可以產生多個波長的光源,，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源,，光源透過測試的樣品后,，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值,，從而轉化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
DNA和RNA都有吸收紫外光的性質,，它們的吸收高峰在260nm波長處,，每種核酸的分子構成不一， 因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當于50μg / ml 的dsDNA,，37μg / ml 的ssDNA,， 40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸,。測試后的吸光值經過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應的樣品濃度，這些由分光光度計內預設的程序執(zhí)行,，因此,，測試前選擇正確的程序，測試樣品的類型,，首先測試空白液,，然后再測試樣品，注意輸入樣品稀釋倍數(shù),。
如何避免吸光值漂移
讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器， 表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。事實上,，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化,，即儀器有一定的準確度和精確度,。
核酸本身物化性質
溶解核酸的緩沖液的pH 值、離子濃度等
在測試時,，離子濃度太高也會導致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH 值一定、離子濃度較低的緩沖液（如TE）可大大穩(wěn)定讀數(shù),。核酸的吸光值受pH值和緩沖液離子濃度影響,。只有在一定的pH值和低離子濃度的條件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0）,，才能得到精確的檢測結果。水的pH值不穩(wěn)定,，可能導致檢測誤差,。一些緩沖液在紫外范圍內存在自身吸收，為了確保準確測量,，請使用與懸浮或洗脫樣品時相同的緩沖液,。
樣品的稀釋濃度
同樣是不可忽視的因素，由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A ,，吸光值最好在0.1-1.5 A,。在此范圍內,，顆粒的干擾相對較小，結果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過低,，或者過高（超過光度計的測試范圍）。
操作因素
如混合要充分,，否則吸光值太低,， 甚至出現(xiàn)負值；混合液不能存在氣泡,，空白液無懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,，否則濃度差異太大,；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項,。
各波長具體含義及相關問題

1.  A260nm
是核酸最高吸收峰的吸收波長，最佳測量值的范圍為0.1至1.0,。如果不在此范圍,，稀釋或濃縮樣品，使之在此范圍內,；如果吸光度小于0.05,，檢查是否存在操作因素（如移液不準確，樣品內有懸浮物等）影響,。DNA樣品的A260 吸光度值是否>0.1,。（請注意,，這個值跟儀器無關，核酸的吸光度必需大于0.1,，其值才有效和可靠,，因為樣品中的雜質和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值<0.1）,；
朗伯－比爾定律：
A 吸光值
I0 入射光強度
I 投射光強度
c 吸光物質的摩爾濃度（mol/L）
d 光通過的液層厚度（cm）
ε 摩爾吸光系數(shù)（Lmol-1cm-1）
2.  A280nm
是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長,，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0,。如果比值低,，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質的污染，需要純化樣品,。比值=1.5相當于50％蛋白質/DNA溶液
3.  A230nm
是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長,，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA和 RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標明樣品被碳水化合物（糖類）,、鹽類或有機溶劑污染,，需要純化樣品。A230產生負值主要是由于在很低DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導致的,。在下一個測定中,，需要降低樣品的稀釋度，A230的負值會被校正,。
4. A320nm或A340nm
為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子,。該值應該接近0.0。如果不是,，標明溶液中有懸浮物,，需要純化樣品。純樣品的A320一般是 0,。
5. A260/A280和A260/A230
是核酸純度的指示值,，純度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值應該在2.0 或2.5,，A260 / A280的比值,， 用于評估樣品的純度， 因為蛋白的吸收峰是280 nm,。 純凈的樣品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響,。
A230是多肽,、芳香基團、苯酚和一些碳氫化合物的吸光度，A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,、多肽、苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0 ,。A280是蛋白質的吸光度。