冷卻水,、冷凝水中嗜肺軍團(tuán)菌檢驗(yàn)方法

本附錄規(guī)定了集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)冷卻水,、冷凝水及其形成的沉積物、軟泥等樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的檢驗(yàn)方法,。

A1原理

待測(cè)水樣經(jīng)過(guò)濾膜或離心濃縮后,，一部分樣品經(jīng)酸處理與熱處理，以減少雜菌生長(zhǎng),，一部分樣品不作處理,。將上述處理與未處理樣品分別接種BCYE瓊脂平板并進(jìn)行培養(yǎng)，生成典型菌落并經(jīng)生化培養(yǎng)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定確認(rèn)則判定為嗜肺軍團(tuán)菌,。

A2 主要儀器設(shè)備

A2.1 平皿：90mm

A2.2 培養(yǎng)箱：35~37℃

A2.3 紫外燈：波長(zhǎng)360±2nm

A2.4 濾膜濾器

A2.5 濾膜：孔徑0.22～0.45µm

A2.6 蠕動(dòng)泵

A2.7 離心機(jī)

A2.8 渦旋振蕩器

A2.9 普通光學(xué)顯微鏡,、熒光顯微鏡、體式鏡

A2.10 水浴箱

A3 采樣

A3.1 采樣容器：可選擇玻璃瓶或聚乙烯瓶,，沉積物與軟泥需用廣口瓶,，容器均需螺口或磨口,，用前滅菌。

A3.2 采樣量：每個(gè)采樣點(diǎn)依無(wú)菌操作取水樣（或沉積物,、軟泥等樣品）約200ml,。

A3.3 中和：經(jīng)氯或臭氧等消毒的樣品，采樣容器滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液以中和樣品中的氧化物,。

A3.4 樣品運(yùn)輸與貯存：樣品最好2天內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室,，不必冷凍，但要避光和防止受熱,，室溫下貯存不得超過(guò)15天,。

A4  方法與步驟

A4.1 樣品處理

A4.1.1 沉淀或離心：如有雜質(zhì)可靜置沉淀或1000r/min離心1min去除。

A4.1.2 過(guò)濾：將經(jīng)沉淀或離心的樣品通過(guò)孔徑0.22～0.45µm濾膜過(guò)濾,，取下濾膜置于15ml滅菌水中,，充分洗脫，備用,。

A4.1.3 熱處理：取1ml洗脫樣品置50℃水浴加熱30min,。

A4.1.4 酸處理：取5ml洗脫樣品，調(diào)pH至2.2,，輕輕搖勻,，放置5min。

A4.2 接種與培養(yǎng)：取A4.1.2洗脫樣品,、A4.1.3 熱處理樣品及A4.1.4 酸處理樣品各0.1ml,，分別接種GVPC平板。將接種平板靜置于CO₂培養(yǎng)箱中,，溫度為35~37℃,，CO₂濃度為2.5%。無(wú)CO₂培養(yǎng)箱可采用燭缸培養(yǎng)法,。觀察到有培養(yǎng)物生成時(shí),，反轉(zhuǎn)平板，孵育10天,，注意保濕,。

A4.3 觀察結(jié)果：軍團(tuán)菌生長(zhǎng)緩慢，易被其它菌掩蓋,，需每天在體式鏡上觀察,。軍團(tuán)菌的菌落顏色多樣，通常呈白色,、灰色、藍(lán)色或紫色,，也能顯深褐色,、灰綠色,、深紅色；菌落整齊,，表面光滑,，呈典型毛玻璃狀，在紫外燈下,，有熒光,。

A4.4 菌落驗(yàn)證：從每一個(gè)平皿上挑取2個(gè)可疑菌落，接種BCYE和L－半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板,，35~37℃培養(yǎng)2天,，凡在BCYE瓊脂平板上生長(zhǎng)而在L－半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板不生長(zhǎng)的則為軍團(tuán)菌菌落。

A4.5嗜肺軍團(tuán)菌型別的確定：應(yīng)進(jìn)行生化培養(yǎng)與血清學(xué)實(shí)驗(yàn)確定嗜肺軍團(tuán)菌,。生化培養(yǎng)：氧化酶（－/弱+）,，硝酸鹽還原－，尿素酶－,，明膠液化＋,，水解馬尿酸。血清學(xué)實(shí)驗(yàn)：用嗜肺軍團(tuán)菌診斷血清進(jìn)行分型,。