在不同的區(qū)室中產(chǎn)生主要皮層細胞類型的類器官用于研究皮層的發(fā)育,、進化和疾病,。然而，在目前的系統(tǒng)中,，缺乏賦予皮質(zhì)位置信息和地形的形態(tài)梯度阻礙了復雜表型的研究,。該研究通過將表達成纖維細胞生長因子8 (FGF8)的組織者樣結構與細長的類器官融合來設計人類皮質(zhì)組裝體，從而實現(xiàn)沿縱向類器官軸的FGF8信號的可控調(diào)節(jié),。這些極化的皮質(zhì)組合體建立了一個位置依賴的轉錄程序,，該程序一定程度上匹配體內(nèi)的前足部基因表達模式，并且在與顳葉畸形和智力殘疾相關的FGFR3基因突變時丟失,。通過在個體組合體中產(chǎn)生與額葉區(qū)和顳葉區(qū)特性相關的空間定向細胞群,，該模型在一定程度上概括了嵌入在原型圖中的早期轉錄差異，并使研究人類疾病的皮層區(qū)域相關改變成為可能,。

大腦皮層是人腦神經(jīng)元處理的主要部位,，具有獨特的解剖、形態(tài)和功能區(qū)域,。盡管神經(jīng)投射(原皮質(zhì)模型)使區(qū)域回路變得尖銳,，但根據(jù)原圖模型，在這些連接出現(xiàn)之前,，通過限制命運決定轉錄因子的表達,，一定程度的實現(xiàn)是指定的。這種模式是由與次級組織的相對細胞距離決定的,，次級組織是分泌被稱為形態(tài)形成因子的擴散因子的細胞群,，從而在周圍組織中產(chǎn)生信號梯度，最終驅動皮層包裹。在人類皮層中,，多種信號傳導組織者和分子參與其中,。盡管皮質(zhì)發(fā)生在不同物種中遵循相似的原則，但人類大腦前額葉的選擇性擴張表明人類對皮質(zhì)區(qū)域規(guī)范的特異性調(diào)節(jié),。然而,，個體分子對人類皮質(zhì)區(qū)域多樣性的精確貢獻以及對大腦疾病的潛在破壞尚未完全了解。

人類多能干細胞(hPSCs)衍生的腦類器官概括了胎兒大腦的轉錄程序和細胞特性,，被廣泛用于研究人類皮質(zhì)發(fā)育和疾病相關改變的分子機制,。盡管一些研究描述了各種因素在hPSCs衍生培養(yǎng)物中調(diào)節(jié)皮質(zhì)區(qū)域命運的能力，但目前的類器官模型缺乏體內(nèi)所見的皮質(zhì)地形,。最近嘗試在腦類器官中引入一定程度的地形,，描述了通過獨立模式類器官融合實現(xiàn)的背腹側軸，皮質(zhì)紋狀體軸,，通過調(diào)節(jié)WNT信號的微流體裝置實現(xiàn)的前腦-后腦軸,，以及iSHH球體-類器官融合策略。然而,，個體皮質(zhì)類器官的體內(nèi)樣喙-尾結構尚未實現(xiàn),。因此,，該研究開始沿著單個類器官的縱軸引入體外定位規(guī)范,，模擬與皮質(zhì)原圖建立相關的早期轉錄差異,，并表征軟骨發(fā)育不全(一種表現(xiàn)出特定皮質(zhì)葉表型的疾病)的病理破壞。

1. FGF8對圓形類器官皮質(zhì)規(guī)格的影響

圖1

2. 長型組合體中的對稱斷裂和圖案形成

由于60 div的圓形類器官通常最大直徑達到2 mm,，因此該研究將hPS細胞聚集在15 mm長的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具內(nèi)，形成可用于組裝體配置的細長類器官(圖2a,b),。在組裝配置中,，隨著時間的推移，tdTomato熒光和形態(tài)學檢查證實,，在組裝體生長過程中,，OrEB仍然位于一個極點,，可作為地形參考(圖2c),。然后，評估了表達FGF8(1%或10%)的OrEB在增加與OrEB的距離時誘導單個細長皮質(zhì)組合體中SP8> GFP表達下降的能力,。報告熒光顯微鏡和形態(tài)學檢查顯示,，60 div培養(yǎng)物中10% CAG>FGF8組裝體的整個長度均表達SP8> GFP，但在1% CAG>FGF8組裝體中,，OrEB附近高表達SP8> GFP(圖2d),，這些組裝體被稱為極化皮質(zhì)組裝體(polCAs)?？v向切片免疫熒光染色顯示,，polCAs近端區(qū)Cpne8和Lmo4陽性的細胞豐度更高，在OrEB遠端區(qū)表達尾側標記物Nr2f1和深層標記物Ctip2的細胞比例更高(圖2e-g),。

圖2

3. 極化皮層類器官（polCAs）中的喙尾樣轉錄梯度

為了檢查沿單個polCAs縱軸出現(xiàn)的頭尾端基因表達梯度,，對60 div的六個單個組合體的近端、中端和遠端(分別為P,、M和D)片段和來自四個對照細長類器官的連續(xù)片段(P1,、P2和P3)進行了RNA-seq分析(圖3a)。主成分分析(PCA)顯示,，與大部分重疊的對照片段形成鮮明對比的是,，來自polCAs的片段是單獨聚集的(圖3b)。沿著PC1,，根據(jù)P - D軸分離的polCA節(jié)段和遠端節(jié)段雖然更近,，但與對照組不同，可能反映了低FGF8水平的暴露(圖3b),。PC1和PC2中的關鍵基因包括與FGF8信號相關的基因,，以及與皮質(zhì)區(qū)域化(FGFR3、LMO3)或神經(jīng)元分化相關的其他基因(NEUROD6,、NEUROD2,、TBR1,、NEUROG2;圖3c)?？鏿olCA結構域的差異基因表達分析發(fā)現(xiàn),，兩個基因簇從近端到遠端高到低表達，其中包含與區(qū)域化,、前后模式規(guī)范,、細胞連接和細胞外基質(zhì)組織相關的基因，以及一個基因簇從近端到遠端低到高表達,，與神經(jīng)元膜電位調(diào)節(jié)和突觸傳遞細化相關(圖3d),，表明多種皮質(zhì)過程的轉錄變化。重要的是,，許多喙端標記顯示預期的從高到低的P - D表達,，而尾側標記具有相反的趨勢(圖3e)，包括與視黃酸(RA)信號相關的基因,，最近與前額葉模式相關,。此外，通過對polCAs的表達模式分析,，發(fā)現(xiàn)了具有陡峭梯度的喙端和尾側基因(包括CBLN2,、MDK、TENMI,、NR2F1,、FGFR3)和其他具有淺梯度的基因(包括DUSP4、POU3F3,、FOXP1,、BCLIIA/CTIP2、NPY;圖3f),。

圖3

4. 致病性FGFR3突變減弱位置效應

引入軟骨發(fā)育不全個體中最常見的突變,，即c.1138G>A點突變，導致一個FGFR3等位基因的蛋白跨膜域發(fā)生p.Gly380Arg替換(圖4a),。然而,，蘇木精和伊紅染色顯示，在野生型(WT) polCA中,，心室區(qū)樣區(qū)域在P區(qū)比D區(qū)大,，而在突變型polCA中，它們在這些位置表現(xiàn)出相似的大小(圖4b),。與此相一致,，在15 div進行的EdU標記和磷酸組蛋白3 (PH3)染色顯示，與WT polCAs的D區(qū)相比,，P區(qū)中S期和M期的細胞豐度增加,，而突變的polCAs則沒有增加(圖4b-d),，表明FGFR3突變時失去了位置依賴性的增殖作用。為了評估突變對轉錄程序的影響,，對突變polCAs的60 div片段進行RNA-seq分析(Pmut, Mmut, Dmut;圖4 e),。PCA分析表明，與WT polCA片段不同,，突變片段沒有沿著PC1分離,，PC1仍然由FGF8信號相關基因和神經(jīng)分化基因驅動(圖4e,f)。特別是,，屬于同一組裝體的Mmut和Dmut片段在PCA中沒有分離(圖4e),，并且所有突變片段都與WT polCA的近端片段聚集在一起，這表明所有突變片段都具有近端同源性,。在WT型polCA中發(fā)現(xiàn)的差異表達基因簇(DEGs)和頭端基因的表達模式在突變型polCA中不再具有片段特異性(圖4),。

圖4

5. polCA的細胞組成和喙尾樣特性

為了確定polCAs中支撐頭尾基因表達的細胞類型組成，使用單細胞RNA-seq分析了解剖的polCAs和對照片段(圖5a),。去除應激細胞后的細胞聚類分析揭示了細胞類型的廣泛多樣性(圖5b-d),，包括循環(huán)放射狀膠質(zhì)細胞(crgc;TOP2A, MKI67),，兩個RGCs簇(RGCl和RGC2;SOX2, NES, VIM),，兩個興奮性神經(jīng)元簇(ExN1和ExN2;DCX, TUBB3)，神經(jīng)元間前體細胞(DLX6-AS1, GAD2),，表達應激反應標志物的細胞(應激相關細胞;HSPA6, GOLGA4)和視網(wǎng)膜祖細胞(VSX2;RORB),。P段和D段以RGC和ExN集群為主，M段以EnC和CB/BRC集群為主,。對聚類組成的檢查突出了不同polCA區(qū)段的差異貢獻,，與D區(qū)段和對照相比，P區(qū)段對RGC2和ExN2簇的貢獻顯著,，而對ExN1和RGC1簇的貢獻較小(圖5e,f),。P段和D段之間的差異豐度分析形式化了定量的細胞類型差異，特別是在RGC和ExN亞型中(圖5g),。為了探索差異代表群體的身份,，在兩個RGC和ExN集群之間進行了差異基因表達分析(圖5h,i)。為了了解RGC和ExN亞型之間的發(fā)育軌跡和關系,，使用力定向圖嵌入來可視化分析cRGC到ExN軌跡上的細胞(圖5j,k),。偽時間分析顯示分化過程中喙端和尾端基因的表達模式存在差異。已知的額葉基因在P譜系中被證實上調(diào),，而顳葉基因在非近端譜系中被高度表達(圖5I),。最大的差異是在RGC到EXN的轉變中觀察到的(圖5I)，強調(diào)了早期的轉錄分化,，與體內(nèi)原圖模型一致,。

圖5

6. 空間分離細胞群的區(qū)域特征

與對照類器官不同,，來自P、M和D段的polCA衍生細胞群沿著PC1軸有效分離,，顯示出與體內(nèi)皮質(zhì)區(qū)域相似的轉錄特性(圖6a-b),。polCA和胎兒組織之間PC1基因負載的比較顯示在細胞類型水平上是一致的(圖6a,b)。事實上,，polCA在近端驅動基因中表現(xiàn)出前額葉標記的明顯富集,，在中端/遠端驅動基因中表現(xiàn)出時間標記的富集，這在對照組中沒有發(fā)現(xiàn)(圖6a,b),，表明在兩個祖先群體中都存在實現(xiàn)梯度,。在興奮性神經(jīng)元中，在保持跨節(jié)段分離的同時,，前額葉驅動基因并未完全定向于PC1近端至中端/遠端軸(圖6a),。

圖6

該研究將表達FGF8的熒光組織體樣聚集體與使用PDMS模具設計的細長類器官融合，在單個組裝體中再現(xiàn)軸向皮質(zhì)圖案,。這一方法利用控制良好的FGF8來源和培養(yǎng)基配方,，以最小的外源信號，沿著組裝體的整個縱軸持續(xù)產(chǎn)生皮層極性,。此外,，開創(chuàng)的polCAs提供了一種將神經(jīng)精神疾病相關的遺傳和環(huán)境改變與個體類器官中特定的早期皮質(zhì)模式事件聯(lián)系起來的方法。

參考文獻

Bosone C, Castaldi D, Burkard TR, Guzman SJ, Wyatt T, Cheroni C, Caporale N, Bajaj S, Bagley JA, Li C, Sorre B, Villa CE, Testa G, Krenn V, Knoblich JA. A polarized FGF8 source specifies frontotemporal signatures in spatially oriented cell populations of cortical assembloids. Nat Methods. 2024 Sep 18. doi: 10.1038/s41592-024-02412-5. Epub ahead of print. PMID: 39294368.