iPS,、H1,、H9等細(xì)胞的基因敲除/點(diǎn)突變/敲入，定制服務(wù)

iPS（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力,，H1,、H9 等人類胚胎干細(xì)胞系同樣是重要的研究模型。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行基因敲除,、點(diǎn)突變或敲入操作,，在再生醫(yī)學(xué)、疾病模型構(gòu)建,、發(fā)育生物學(xué)以及藥物研發(fā)等領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)意義,。例如，通過基因編輯可以模擬人類遺傳性疾病,，為研究疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供細(xì)胞模型,；在再生醫(yī)學(xué)中，可優(yōu)化干細(xì)胞的分化潛能以用于細(xì)胞治療,；還能為藥物研發(fā)篩選更精準(zhǔn)的靶點(diǎn)和評(píng)估藥物療效,。

二、基因編輯技術(shù)及原理

（一）CRISPR - Cas9 系統(tǒng)

這是目前廣泛應(yīng)用于這些細(xì)胞基因編輯的技術(shù),。它由 Cas9 蛋白和引導(dǎo) RNA（gRNA）組成,。gRNA 特異性識(shí)別目標(biāo)基因序列，引導(dǎo) Cas9 蛋白到該位點(diǎn),，Cas9 蛋白像 “分子剪刀” 一樣在目標(biāo) DNA 雙鏈上產(chǎn)生切割,，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制。

（二）基因敲除

當(dāng)目標(biāo)基因被切割后，細(xì)胞主要通過非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)機(jī)制,。這種修復(fù)容易出錯(cuò),，可能導(dǎo)致基因序列插入或缺失，從而破壞基因的閱讀框或關(guān)鍵功能域,，實(shí)現(xiàn)基因敲除,。

（三）點(diǎn)突變

對(duì)于點(diǎn)突變，可通過向細(xì)胞同時(shí)導(dǎo)入 gRNA,、Cas9 蛋白和含有特定點(diǎn)突變的單鏈寡核苷酸（ssODN）供體,。在 Cas9 切割產(chǎn)生雙鏈斷裂后，細(xì)胞利用 HDR（同源定向修復(fù)）機(jī)制,，以 ssODN 為模板進(jìn)行修復(fù),，實(shí)現(xiàn)特定堿基的替換，完成點(diǎn)突變,。

（四）基因敲入

在基因敲入時(shí),，設(shè)計(jì)帶有目的基因片段和與目標(biāo)位點(diǎn)兩側(cè)同源臂的供體 DNA。細(xì)胞在 Cas9 切割后,，通過 HDR 途徑將供體 DNA 整合到目標(biāo)位點(diǎn),，實(shí)現(xiàn)基因敲入。在 iPS,、H1,、H9 等細(xì)胞中，HDR 效率相對(duì)較低,，需要優(yōu)化條件提高編輯效率,。

三、編輯流程

（一）設(shè)計(jì)編輯元件

針對(duì)目標(biāo)基因,，設(shè)計(jì)合適的 gRNA,。對(duì)于點(diǎn)突變和敲入操作，還要精心設(shè)計(jì)供體 DNA 或 ssODN,。要充分考慮脫靶效應(yīng),，通過生物信息學(xué)分析和驗(yàn)證確保編輯的特異性。

（二）轉(zhuǎn)染方法

將編輯元件（gRNA,、Cas9 蛋白,、供體 DNA 或 ssODN）導(dǎo)入細(xì)胞。對(duì)于 iPS,、H1,、H9 等細(xì)胞，常用的轉(zhuǎn)染方法有電穿孔,、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和病毒載體介導(dǎo)等,。電穿孔效率較高但可能對(duì)細(xì)胞有一定損傷；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相對(duì)溫和但效率因細(xì)胞而異,；病毒載體介導(dǎo)可提高轉(zhuǎn)染效率,，但存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，需要謹(jǐn)慎使用,。

齊岳小編axc