測(cè)序數(shù)據(jù)量也被稱為下機(jī)數(shù)據(jù)量，通常測(cè)序數(shù)據(jù)量的單位都是用“G'表示,，例如1G,。（多嘴：這里所說的G[堿基數(shù)Gbase，Gb]和文件在硬盤上的大小G[gigabyte,，GB]不是一回事）1G=10^3 M,，1M=10^3 kb，1kb=10^3 byte（1個(gè)堿基=1 byte）所以,，1G的數(shù)據(jù)量=10^9=10億個(gè)堿基,。 M：用于描述reads數(shù),，G：用于描述本次測(cè)序獲得的堿基總數(shù),。測(cè)序公司給你的文件通常是壓縮的fastq格式，里面有read ID號(hào),，有堿基,，有每個(gè)堿基的質(zhì)量。上述提到的Reads指的是高通量測(cè)序儀一次測(cè)序所獲得的堿基序列,，由一連串堿基ATCGATCG等構(gòu)成,，它并不是基因組的組成部分。不同的測(cè)序儀器,，reads長(zhǎng)度也有所不同,。為什么不同的測(cè)序儀器，reads長(zhǎng)度也有所不同,？因?yàn)槎鷾y(cè)序的讀長(zhǎng)能力是有限的,。二代測(cè)序基本上都是基于DNA聚合酶的延伸將帶有熒光基團(tuán)的dNTP加到模板上，通過一個(gè)個(gè)的互補(bǔ)配對(duì)將序列依次讀取出來,。Illumina和華大測(cè)序儀都是相同原理,。在延伸了一段時(shí)間后，聚合酶的活力就會(huì)大大降低,，錯(cuò)誤率也會(huì)越來越高,。當(dāng)錯(cuò)誤率高到不可容忍的時(shí)候，就必須停止測(cè)序反應(yīng),。所以就有了陸續(xù)推出的單端SE50,、SE100、SE150,、SE250以及雙端的PE50,、PE100、PE150,、PE300,，也就意味著，測(cè)序儀可以控制讀取長(zhǎng)度的，儀器會(huì)順著DNA一個(gè)堿基一個(gè)堿基的讀取,，在機(jī)器開始測(cè)序前,，可以設(shè)置讀取的循環(huán)數(shù)，例如100Cycle.那么NGS測(cè)序儀就會(huì)讀取100個(gè)堿基,，即SE100,。 但是目前來講，由于自身方法的局限性（包括酶的失活,，阻斷基團(tuán)切割的效率等等都會(huì)導(dǎo)致測(cè)序質(zhì)量隨著測(cè)序長(zhǎng)度不可逆地降低）仍然難以突破,。這也就是二代達(dá)不到一代測(cè)序的長(zhǎng)度，更不可能到三代的長(zhǎng)度,。文庫的構(gòu)建,，插入長(zhǎng)度（insert length, ins_length）要限制在一定范圍內(nèi)（300~500bp），當(dāng)然這時(shí)候片段長(zhǎng)度仍具有隨機(jī)性,，也不能100%保證,。1、對(duì)于長(zhǎng)于300bp的序列,，無法測(cè)通,，會(huì)給出序列兩端長(zhǎng)150bp的reads，中間沒有overlap,；2,、對(duì)于150-300bp的序列，可以測(cè)通,，會(huì)給出序列兩端長(zhǎng)150bp的reads,，中間有overlap；3,、對(duì)于短于150bp的序列,，它會(huì)測(cè)到頭沒了，這時(shí)候再拍照這個(gè)地方是黑的,，怎么辦,？測(cè)序儀會(huì)記錄為N或者連續(xù)的A/G，所以一些reads的末尾全是N（也即無法確定有效堿基）,。這時(shí)候仍會(huì)給出兩個(gè)長(zhǎng)度150bp的reads,，雙末端的reads去掉末尾N是反向互補(bǔ)的。在基因組層面上,，測(cè)序主要可以分為三大類：全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing,，WGS）、全外顯子組測(cè)序（whole-exome sequencing,，WES）,、靶向測(cè)序（targeted sequencing或panelsequencing）,。 各檢測(cè)方案示意圖（Klein CJ.et.al. Mayo Clin Proc.2017）其一測(cè)序深度（Sequencing depth）指測(cè)序得到的堿基總量（bp）與目標(biāo)基因組大小的比值，即測(cè)序深度=數(shù)據(jù)量大小 / 目標(biāo)基因組大小,。或者理解為目標(biāo)基因組區(qū)間內(nèi)中每個(gè)堿基被測(cè)序到的平均次數(shù),，如測(cè)序數(shù)據(jù)量為1G，測(cè)序的基因組大小為1M,，那么測(cè)序深度為1G/1M=1000×,。其二測(cè)序覆蓋度（Sequencing coverage） 指測(cè)序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例?；蛘呖梢岳斫鉃槟繕?biāo)基因組上至少被檢測(cè)到1次的區(qū)域（或者是堿基）,，占整個(gè)基因組的比例。
由于基因組中的高GC,、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在,，測(cè)序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區(qū)域，這部分沒有獲得的區(qū)域就稱為Gap,。例如一個(gè)細(xì)菌基因組測(cè)序,，覆蓋度是98%,，那么還有2%的序列區(qū)域是沒有通過測(cè)序獲得的,。
測(cè)序深度與基因組覆蓋度之間是一個(gè)正相關(guān)的關(guān)系，測(cè)序帶來的錯(cuò)誤率或假陽性結(jié)果會(huì)隨著測(cè)序深度的提升而下降,。其三捕獲效率（Capture efficiency）指的是比對(duì)到參考基因組中目標(biāo)區(qū)域的數(shù)據(jù)量占比對(duì)到參考基因組上總數(shù)據(jù)量的比例,。捕獲效率越高，說明有效數(shù)據(jù)比例高,。比如一個(gè)Panel大小為3M,，測(cè)序共產(chǎn)出3G數(shù)據(jù)。對(duì)于Panel大小大于1M的文庫來說,，捕獲效率往往在60%左右,，也即測(cè)序得到的數(shù)據(jù)有60%是所需的數(shù)據(jù)，則在目標(biāo)區(qū)域的數(shù)據(jù)為3G*60%=1.8G,。粗略計(jì)算測(cè)序深度=1.8G/3M=600乘（X）,。所以，對(duì)于對(duì)于這個(gè)Panel大小為3M,，數(shù)據(jù)產(chǎn)出為3G的文庫來說,，測(cè)序深度大概為600乘。這個(gè)測(cè)序深度指的是原始平均測(cè)序深度,。確定了測(cè)序深度,，測(cè)序數(shù)據(jù)量就很好計(jì)算了。數(shù)據(jù)量大小=測(cè)序深度*基因組大小,。 一般來說,，若是針對(duì)人的WGS，常規(guī)測(cè)序數(shù)據(jù)量是90G，測(cè)序深度30x,；WES的話,，則是10G，測(cè)序深度100x,；靶向測(cè)序的話,，視panel大小、測(cè)序深度等而定,。那么,，問題來了：為什么是90G或10G？測(cè)序深度又為什么是30x或100x,？......人體基因組的大小約為30億個(gè)堿基對(duì),，即3000Mbp。通過單位換算,，就是3G,。人體約有39000多個(gè)基因,，平均的基因大小有27kbp。問題1：人WGS的測(cè)序數(shù)據(jù)量為什么是90G,，測(cè)序深度30x,？回答：WGS的目的是準(zhǔn)確檢測(cè)個(gè)體間的變異情況，尋找變異與疾病及表型之間的關(guān)系,。因此,，變異的精確度和靈敏性成了檢測(cè)變異的兩個(gè)重要的指標(biāo)。由于測(cè)序存在著不可避免的系統(tǒng)錯(cuò)誤,，每一個(gè)位點(diǎn)只有在足夠的reads支持下才能確保正確性,。在SNP calling（識(shí)別）中，檢測(cè)出一個(gè)SNP位點(diǎn)最起碼需要4條reads,。4X以上的平均測(cè)序深度是數(shù)據(jù)量是否足夠的一項(xiàng)重要指標(biāo),。在30X的時(shí)候，大于4X的比例達(dá)99.21%,，并趨于飽和,，與覆蓋度接近。基于此,，若要進(jìn)行人的WGS,，測(cè)序數(shù)據(jù)量就是30x*3G=90G。問題2：人WES的測(cè)序數(shù)據(jù)量為什么是10G,，測(cè)序深度100x,？對(duì)于WES而言,，在建庫過程中需要通過雜交捕獲步驟得到外顯子序列。常用的外顯子組探針如Aglient V6,，捕獲效率介于60%~70%之間,，探針大小為60M。為了保證大部分的區(qū)域有足夠的覆蓋倍數(shù),，需提高測(cè)序深度,。研究顯示，WES想要獲得與WGS相同的覆蓋范圍,，覆蓋89.6-96.8％的目標(biāo)堿基,，需要測(cè)到80x。一般建議測(cè)序深度達(dá)到100x,。所以WES測(cè)序數(shù)據(jù)量=100x*60M/60%=10G,。其中，panel測(cè)序有兩種技術(shù)原理：雜交捕獲測(cè)序和多重?cái)U(kuò)增子測(cè)序,。全外是基于序列雜交原理實(shí)現(xiàn)的,。二代測(cè)序的讀長(zhǎng)為什么是固定的？- 知乎 (zhihu.com) Klein CJ, Foroud TM. Neurology Individualized Medicine: When to Use Next-Generation Sequencing Panels. Mayo Clin Proc. 2017 Feb;92(2):292-305. doi: 10.1016/j.mayocp.2016.09.008. PMID: 28160876.生信路漫漫 | 測(cè)序數(shù)據(jù)量是怎么來的,？- 知乎 (zhihu.com)全外測(cè)序（WES） - 知乎 (zhihu.com)
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