小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先天免疫細(xì)胞,，通過(guò)支持神經(jīng)元的成熟和完善突觸連接，積極參與大腦的發(fā)育,。這些細(xì)胞具有高度的代謝靈活性,，能夠氧化不同的能量底物以滿(mǎn)足它們的能量需求。乳酸在大腦中特別豐富,，但小膠質(zhì)細(xì)胞是否使用它作為代謝燃料尚不清楚,。

2023年9月16日洛桑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系Rosa Chiara Paolicelli研究團(tuán)隊(duì)在Nature communications發(fā)表論文“Loss of microglial MCT4 leads to defective synaptic pruning and anxiety-like behavior in mice”。揭示了小膠質(zhì)細(xì)胞MCT4的缺失導(dǎo)致小鼠突觸修剪缺陷和焦慮樣行為,。

在這里,，作者表明，小膠質(zhì)細(xì)胞可以輸入乳酸,，這是結(jié)合增加溶酶體酸化,。在體外，小膠質(zhì)細(xì)胞中單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體MCT4的丟失阻止了乳酸誘導(dǎo)的溶酶體調(diào)節(jié),，體內(nèi)MCT4的小膠質(zhì)細(xì)胞缺失導(dǎo)致突觸棘受損,，與海馬神經(jīng)元興奮增加、AMPA/GABA比值增強(qiáng),、癲癇發(fā)作易感性和焦慮樣表型相關(guān),。總的來(lái)說(shuō),，這些發(fā)現(xiàn)表明,，小膠質(zhì)細(xì)胞中MCT4轉(zhuǎn)運(yùn)體的選擇性破壞足以改變突觸的細(xì)化，并誘導(dǎo)小鼠大腦發(fā)育和成人行為的缺陷,。

圖一 小膠質(zhì)細(xì)胞是代謝多功能的細(xì)胞,，可以有效地輸入乳酸

為了評(píng)估代謝靈活性的轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)，作者分析了從成年Cx3cr1GFP小鼠大腦中急性分離出來(lái)的小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)譜與主要細(xì)胞內(nèi)KEGG代謝通路的關(guān)系,。發(fā)現(xiàn)每個(gè)代謝途徑中的大部分基因都在小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá),。通過(guò)模塊評(píng)分分析了小膠質(zhì)細(xì)胞中KEGG通路基因的表達(dá)。與其他類(lèi)型的細(xì)胞相比,，小膠質(zhì)細(xì)胞在氧化磷酸化和糖酵解方面顯示出相對(duì)較高的模塊評(píng)分,。總之,，這些數(shù)據(jù)表明了小膠質(zhì)細(xì)胞在原則上具有代謝多種能量底物的內(nèi)在能力,。LDHB是參與小膠質(zhì)細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)的最豐富的基因之一,。此外，LDHB在成年小鼠海馬的所有其他腦細(xì)胞類(lèi)型中的小膠質(zhì)細(xì)胞中高度富集,，其在這些細(xì)胞中的表達(dá)在出生后的第二周達(dá)到高峰,，這是一個(gè)高度突觸重塑的時(shí)間。由于含LDHB的亞型在優(yōu)先將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的細(xì)胞中富集,，推測(cè)其在小膠質(zhì)細(xì)胞中的高水平可能是乳酸代謝的重要作用的基礎(chǔ),。作者通過(guò)質(zhì)譜證實(shí)，與對(duì)照組相比,，暴露于20 mM乳酸鈉的初級(jí)小膠質(zhì)細(xì)胞的乳酸水平增加了約4倍,，表明這些細(xì)胞中有顯著的乳酸輸入。這些發(fā)現(xiàn)支持了小膠質(zhì)細(xì)胞能夠內(nèi)化細(xì)胞外的乳酸,。

圖二 乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體MCT4在小膠質(zhì)細(xì)胞中響應(yīng)細(xì)胞外乳酸而上調(diào),，是乳酸依賴(lài)性溶酶體酸化所必需的

乳酸可以通過(guò)一類(lèi)質(zhì)子連接的溶質(zhì)載體成員通過(guò)細(xì)胞膜運(yùn)輸，SLC載體攜帶一個(gè)羧酸基的分子,，如乳酸、丙酮酸和酮,，因此定義為單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,。在包含MCTs家族的14個(gè)亞型中，大腦中高度豐富的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體是MCT1,、MCT2和MCT4,，它們也在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。在暴露于25 mM乳酸鈉24小時(shí)后,，僅觀(guān)察到原代小膠質(zhì)細(xì)胞中編碼MCT4的Slc16a3轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào),，而MCT1或MCT2沒(méi)有任何變化。乳酸暴露也顯著在蛋白水平上增加了MCT4,，這些發(fā)現(xiàn)支持了MCT4在小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外乳酸可利用性的反應(yīng)中的直接作用,。接下來(lái)進(jìn)一步闡明MCT4的下游調(diào)控作用。在氧化細(xì)胞中,，乳酸輸入已被證明通過(guò)LDHB活性介導(dǎo)溶酶體酸化和蛋白水解功能,。考慮到LDHB在小膠質(zhì)細(xì)胞中的高表達(dá),，以及它們內(nèi)化乳酸的能力,，對(duì)溶酶體酸化的影響是由乳酸特異性誘導(dǎo)的，而不是由其他單羧酸鹽,。這些發(fā)現(xiàn)表明,，細(xì)胞外乳酸導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞中晚期核內(nèi)體和溶酶體的酸化增強(qiáng)，而這嚴(yán)格依賴(lài)于MCT4轉(zhuǎn)運(yùn)體,。缺乏MCT4的小膠質(zhì)細(xì)胞顯示出乳酸誘導(dǎo)的降解細(xì)胞器酸化缺陷,，提示其吞噬功能可能受到損害,。

圖三 在小膠質(zhì)細(xì)胞中選擇性消耗MCT4會(huì)損害吞噬作用

溶酶體腔內(nèi)pH對(duì)于底物貨物的最佳降解至關(guān)重要。因此,，作者想知道小膠質(zhì)細(xì)胞MCT4的缺失是否會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力的功能障礙,。為此，在對(duì)照組和KO原代細(xì)胞中進(jìn)行了DQ-BSA檢測(cè),。DQ-BSA是蛋白酶的熒光底物,，其熒光通過(guò)BODIPY染料標(biāo)記而被猝滅。當(dāng)DQ-BSA被蛋白酶水解為單肽時(shí),，猝滅被緩解,，因此，熒光信號(hào)可以作為蛋白水解活性的代理,。信號(hào)定量結(jié)果顯示,，與對(duì)照組相比，KO小膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生的熒光顯著降低,，表明其降解能力存在缺陷,。作者想探究在體內(nèi)乳酸的功能反應(yīng)是否也可能發(fā)生改變，從而影響MCT4 cKO小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的突觸重構(gòu),。乳酸在圍產(chǎn)期的大腦中特別豐富,，這與該代謝物在早期發(fā)育窗口的關(guān)鍵作用相一致。因此,，開(kāi)始通過(guò)MCT4 cKO小鼠系來(lái)研究小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)乳酸驅(qū)動(dòng)的大腦發(fā)育影響的具體作用,。海馬是一個(gè)與認(rèn)知功能高度相關(guān)的結(jié)構(gòu)，在出生后早期通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行深刻的突觸細(xì)化,。測(cè)量了野生型小鼠在出生后15天大腦中的乳酸,，并將其在海馬體中的水平與更多尾側(cè)新皮質(zhì)區(qū)域進(jìn)行了比較。質(zhì)譜分析顯示,，海馬體中的乳酸含量明顯高于其他新皮質(zhì)區(qū)域,，這支持了該代謝物在該結(jié)構(gòu)中的作用。為了闡明小膠質(zhì)細(xì)胞乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)在海馬發(fā)育中的作用,，通過(guò)在Cx3cr1CREert2/+的P6和P8選擇性地消耗小膠質(zhì)細(xì)胞中的MCT4,；結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCT4 KO小膠質(zhì)細(xì)胞中吞噬溶酶體大小的增加可能反映了攝取物質(zhì)的功能失調(diào)清除，這可能包括突觸物質(zhì),。

圖四 MCT4 cKO小鼠的突觸剪枝缺陷

出生后的早期幾周是大腦的一個(gè)關(guān)鍵發(fā)育窗口,，其中小膠質(zhì)細(xì)胞的突觸修剪與促進(jìn)突觸連接的適當(dāng)細(xì)化特別相關(guān)。因此,，作者假設(shè)MCT4 cKO小鼠,，如果在小膠質(zhì)細(xì)胞酰化清除方面有缺陷，將會(huì)表現(xiàn)出突觸結(jié)構(gòu)的積累,。因此,，對(duì)P15小鼠的海馬勻漿進(jìn)行了免疫印跡分析，在海馬切片上的免疫染色進(jìn)一步證實(shí)突觸素顯著增加,。對(duì)突觸前和突觸后標(biāo)記物和homer1之間的共定位斑點(diǎn)進(jìn)行定量,，發(fā)現(xiàn)突觸數(shù)量顯著增加，支持MCT4小膠質(zhì)細(xì)胞缺失引起的結(jié)構(gòu)變化,。對(duì)照同窩小鼠相比,，MCT4 cKO之間的樹(shù)突棘密度沒(méi)有變化，與突觸后支架蛋白homer1和PSD95的水平?jīng)]有變化相一致,。這些數(shù)據(jù)表明,，小膠質(zhì)細(xì)胞中MCT4的選擇性丟失不僅會(huì)導(dǎo)致內(nèi)在的小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙，而且足以在突觸水平上誘發(fā)后果,。為了進(jìn)一步研究突觸標(biāo)記物的增加是否與體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞修剪缺陷直接相關(guān),，作者評(píng)估了對(duì)照組和cKO小鼠CA1海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)突觸蛋白的吞噬情況。在cKO小鼠中,，被吞噬的突觸斑點(diǎn)的數(shù)量明顯增加,，這與體外觀(guān)察到的有缺陷降解和隨后產(chǎn)生的攝入物質(zhì)的積累相一致?？偟膩?lái)說(shuō),，這些數(shù)據(jù)突出了小膠質(zhì)細(xì)胞MCT4在介導(dǎo)出生后早期海馬體突觸消除中的關(guān)鍵作用。

圖五 小膠質(zhì)細(xì)胞MCT4的缺失會(huì)在海馬體中產(chǎn)生突觸適應(yīng)和代謝變化

接下來(lái),，作者研究了MCT4 cKO小鼠的缺陷突觸重構(gòu)是否對(duì)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)傳遞有功能性影響,。從幼年小鼠中制備急性腦切片,，并對(duì)CA1錐體細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗記錄,。與對(duì)照組相比，在cKO小鼠中記錄的自發(fā)性興奮性突觸后電流的振幅顯著升高,，sEPSC的頻率也有相似的趨勢(shì),。這些結(jié)果表明CA1錐體神經(jīng)元有更大的突觸興奮，這一現(xiàn)象與突觸蛋白和GluA2等突觸蛋白水平的變化相一致,。此外,，在P15小鼠的海馬切片中， cKO小鼠的錐體神經(jīng)元的AMPA/GABA比值增加,。小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙和CA1錐體細(xì)胞上更高的突觸興奮先前已經(jīng)被認(rèn)為與提供癲癇發(fā)作的易感性有關(guān),。在對(duì)照組小鼠中，腹腔注射2 mg/kg的紅藻氨酸并沒(méi)有引起任何與癲癇發(fā)作相關(guān)的反應(yīng),。然而,，100%的cKO雄性和雌性早在注射后1小時(shí)就出現(xiàn)了陣攣性發(fā)作。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了小膠質(zhì)細(xì)胞MCT4的缺失導(dǎo)致了幼年小鼠海馬體突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變,。對(duì)三羧酸循環(huán)的分析顯示,，中間代謝產(chǎn)物琥珀酸顯著增加,，這與其在促進(jìn)癲癇發(fā)作中的積累作用一致。由于脂肪酸,、葡萄糖和氨基酸的代謝可以產(chǎn)生ACs,，在cKO小鼠中發(fā)現(xiàn)的高水平可能表明，在沒(méi)有小膠質(zhì)細(xì)胞MCT4的情況下,，存在代謝適應(yīng),。

圖六 成年cKO小鼠表現(xiàn)出類(lèi)似焦慮的行為

在大腦發(fā)育過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的回路重構(gòu)的缺陷往往會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期的行為后果,。因此,，為了研究小膠質(zhì)細(xì)胞出生后早期MCT4的缺失是否會(huì)導(dǎo)致成年期的行為改變，作者進(jìn)行了幾項(xiàng)行為測(cè)試評(píng)估小鼠行為,。證實(shí)了小膠質(zhì)細(xì)胞中MCT4的消耗是長(zhǎng)期的,，在成年期cKO的顯著降低。小鼠首先在曠場(chǎng)試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試,，以評(píng)估基本的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)和類(lèi)似焦慮的行為,。雖然性別和基因型之間的運(yùn)動(dòng)和靜止時(shí)間具有可比性，但與對(duì)照組相比,，成年cKO雄性探索礦場(chǎng)中心的時(shí)間明顯更少,，在中心行走的距離也更短，表明焦慮增加,。該行為在高架十字迷宮試驗(yàn)中得到了證實(shí),，在該試驗(yàn)中，cKO雄性在閉合臂上停留的時(shí)間明顯更多,，它們也表現(xiàn)出更多的靜止時(shí)間,，在高架十字迷宮的探索和平均速度顯著降低。此外,，作者還分析了小鼠的自我梳理的行為,，包括對(duì)新環(huán)境的反應(yīng)和對(duì)物理刺激的反應(yīng)。與對(duì)照組相比,，cKO雄性在兩種梳理中表現(xiàn)出相似的水平,，而cKO雌性在噴霧誘導(dǎo)的梳理中表現(xiàn)出顯著的減少。最后,，作者還使用巴恩斯迷宮和Y迷宮測(cè)試了運(yùn)動(dòng)表現(xiàn),、空間記憶和工作記憶。在這些測(cè)試中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何差異,，這表明空間記憶和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)不受小膠質(zhì)細(xì)胞MCT4缺失的影響,。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)支持了cKO小鼠焦慮樣行為的長(zhǎng)期改變,，伴隨著結(jié)構(gòu)突觸的改變,，表明小膠質(zhì)細(xì)胞MCT4的缺失足以影響成年期復(fù)雜的大腦功能和突觸的完整性。

總之,，作者發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞乳酸輸入通過(guò)MCT4依賴(lài)的機(jī)制調(diào)節(jié)溶酶體酸化,。MCT4的選擇性小膠質(zhì)細(xì)胞消耗會(huì)導(dǎo)致吞噬功能受損和突觸修剪的改變。在功能上,，這與海馬神經(jīng)元興奮增加,、紅藻氨酸誘發(fā)癲癇的易損性增強(qiáng)以及成年cKO動(dòng)物焦慮樣表型的發(fā)作有關(guān)。

文章來(lái)源

https:///10.1038/s41467-023-41502-4

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