編譯：洛雪，編輯：夏甘草,、江舜堯,。

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導(dǎo)讀

microRNAs與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),，已知在阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病中存在miR155的失調(diào),。本文研究了不同月齡（4月齡,、8月齡、10月齡）的miR155缺陷型的野生型及阿爾茲海默病模型小鼠的行為學(xué),、神經(jīng)病理學(xué)及皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征,。

結(jié)果表明，miR155敲除的8月齡APP/PSEN1小鼠腦中Aβ沉積增多,、突觸功能恢復(fù)，但miR155敲除可提高4月齡和8月齡APP/PSEN1小鼠Barnes迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力,，進(jìn)一步探索了miR155缺失對(duì)前額葉皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組的轉(zhuǎn)錄影響,，與APP代謝之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)miR155在APP/PSEN1小鼠的海馬齒狀回和AD病人的海馬CA1區(qū)上調(diào),，作者還整合了來自四個(gè)地區(qū)的AD病人的六個(gè)大腦區(qū)域RNA序列,，發(fā)現(xiàn)miR155缺陷型的AD模型小鼠中與miR155缺失相關(guān)基因的表達(dá)變化，同AD病人的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)類似,，進(jìn)一步確證了miR155的缺失與人類AD疾病的相關(guān)性,。并發(fā)現(xiàn)miR155缺失可致AD樣腦轉(zhuǎn)錄改變，上調(diào)了與阿爾茨海默病相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn),，說明了miR155的失調(diào)與人類晚發(fā)性AD疾病至少在以下4個(gè)領(lǐng)域具有相關(guān)性：(1)天然免疫反應(yīng)途徑,；(2) 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；(3)突觸病理,；(4) β-淀粉樣蛋白沉積,。

原名：miR155 regulation of behavior, neuropathology, and cortical transcriptomics in Alzheimer's disease

譯名：miR155對(duì)阿爾茲海默病行為學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)及皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的調(diào)控

期刊：Acta Neuropathologica

IF：14.251

發(fā)表時(shí)間：2020.9

通訊作者：Joel T Dudley &Michelle E Ehrlich

通訊作者單位：美國(guó)紐約西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院

DOI號(hào)：10.1007/s00401-020-02185-z

1 miR155敲除的8月齡APP/PSEN1小鼠腦中Aβ沉積增多

圖1 在8月齡APP / PSEN1小鼠中,， miR155敲除會(huì)增加腦Aβ沉積,，但不會(huì)改變小膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。a,d 8月齡的APP/PSEN1和APP/PSEN1; miR155-/-小鼠大腦中的6E10免疫反應(yīng)的斑塊（紅色）和Iba1免疫染色的小膠質(zhì)細(xì)胞（綠色）的圖像,。b-c,e-g 6E10 和Iba1染色統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果,。h-k前額葉皮層（左）和海馬（右）中硫黃素S標(biāo)記的淀粉樣蛋白斑（紅色）和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞（綠色）染色結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析圖。

為了了解miR155的缺失是否調(diào)控APP/PSEN1小鼠中Aβ種類不同,，研究人員測(cè)量了8月齡APP/PSEN1和APP/PSEN1,；miR155?/?小鼠腦組織中Aβ40、Aβ42,、Aβ42/Aβ40的水平,，結(jié)果表明miR155缺失不影響Aβ40、Aβ42,、Aβ42/Aβ40在每個(gè)生化組分（TBS,、Triton-X和甲酸）中的水平，但在甲酸組分中時(shí),，miR155的缺失引起了Aβ42/Aβ40的下調(diào)（表1）,，但二者的APP全蛋白水平?jīng)]有顯著差異。

表1 8月齡APP/PSEN1和APP/PSEN1,；miR155?/?小鼠腦組織中Aβ水平

2 miR155敲除對(duì)8月齡APP/PSEN1小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活無影響

研究人員觀察到APP/PSEN1,；miR155?/?小鼠腦內(nèi)Aβ沉積增加，且有研究報(bào)道膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)炎癥在Aβ沉積中發(fā)揮關(guān)鍵作用,。研究人員進(jìn)一步研究了miR155敲除對(duì)8月齡APP/PSEN1小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響(圖1d-g,，j-k)。免疫熒光染色表明,，在APP/PSEN1和APP/PSEN1,；miR155?/?小鼠中 Iba1+的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及熒光強(qiáng)度無明顯差異（圖1d-g）. 在兩種小鼠的皮層和海馬區(qū)域， GFAP+星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及熒光強(qiáng)度也無明顯差異（圖1j-k）

3 miR155敲除可使10月齡APP/PSEN1小鼠突觸可塑性有所恢復(fù),，使WT小鼠出現(xiàn)突觸功能障礙

為了進(jìn)一步研究miR155敲除對(duì)10月齡APP/PSEN1和WT小鼠突觸可塑性的影響,，研究人員選擇了急性海馬腦片作為研究對(duì)象(圖2a)。與WT小鼠相比,，APP/PSEN1小鼠海馬CA3-CA1基礎(chǔ)突觸傳遞損傷 (圖2b),。與WT小鼠相比,，miR155敲除的WT小鼠海馬CA3-CA1基礎(chǔ)突觸傳遞損傷，且損傷程度與APP/PSEN1小鼠類似,。但有趣的是,，與APP/PSEN1小鼠相比，APP/PSEN1,；miR155?/?小鼠海馬CA3--CA1基礎(chǔ)突觸傳遞損傷程度減輕,，且恢復(fù)至與WT小鼠類似水平，APP/PSEN1小鼠miR155的缺失恢復(fù)了WT小鼠正常的基礎(chǔ)突觸傳遞,，即糾正了APP/PSEN1缺陷,。

配對(duì)脈沖促進(jìn)(PPF)，指的是當(dāng)一個(gè)突觸被一短暫間隔的雙脈沖刺激后,第二個(gè)反應(yīng)會(huì)明顯強(qiáng)于第一個(gè)反應(yīng)的現(xiàn)象,，描述的是一種短時(shí)程突觸可塑性,。短時(shí)程的突觸可塑性是突觸可塑性的一種重要表現(xiàn)形式，研究人員也檢測(cè)了這一突觸可塑性指標(biāo),，結(jié)果表明,，10月齡的APP/PSEN1短時(shí)程突觸可塑性受抑制，而miR155的缺失可以部分改善,。WT小鼠與miR155敲除的WT小鼠對(duì)短時(shí)程的突觸可塑性無明顯影響(圖2c),。

研究人員還研究了突觸可塑性的兩種長(zhǎng)時(shí)形式，即長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和DHPG誘導(dǎo)的長(zhǎng)時(shí)程抑制(LTD),。同上文中的基礎(chǔ)突觸傳遞損傷結(jié)果類似,，與WT小鼠相比，APP/PSEN1小鼠LTP減弱,，而miR155的缺失可使APP/PSEN1小鼠LTP減弱有所恢復(fù),，但miR155的缺失使WT小鼠LTP減弱至與APP/PSEN1小鼠類似水平。但與WT小鼠相比,，APP/PSEN1小鼠LTD受損,，而miR155的缺失不能使APP/PSEN1小鼠LTD受損有所恢復(fù),，miR155的缺失也會(huì)使WT小鼠LTD受損,。

圖2 miR155敲除使10月齡APP/PSEN1小鼠突觸可塑性有所恢復(fù)，使WT小鼠出現(xiàn)突觸功能障,。a急性海馬腦片記錄突觸電位的電極放置,。b fEPSP 幅值mv/ms，反映突觸功能,。c配對(duì)脈沖促進(jìn)(PPF)情況,。d,e突觸誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP ）和長(zhǎng)時(shí)程抑制(LTD)

4 miR155敲除可提高4月齡和8月齡APP/PSEN1小鼠Barnes迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力

Barnes巴恩斯迷宮用于評(píng)估大小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。迷宮表面使用強(qiáng)光照明讓動(dòng)物產(chǎn)生厭惡,，給動(dòng)物找到正確的洞穿過迷宮表面的機(jī)會(huì),，下方是一個(gè)“安全盒”,，研究者測(cè)量動(dòng)物到“安全盒”需要的總的時(shí)間。潛伏期越短,，說明動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng),。(圖3a)

與WT小鼠相比4月齡和8月齡的APP/PSEN1小鼠均表現(xiàn)出學(xué)習(xí)和行為障礙。4月齡APP/PSEN1小鼠進(jìn)入“安全盒”的潛伏期延長(zhǎng)(圖3b),，8月齡APP/PSEN1小鼠尋找“安全盒”的潛伏期延長(zhǎng)(圖3c),。與APP/PSEN1小鼠相比，兩個(gè)年齡段的APP/PSEN1,；miR155?小鼠均表現(xiàn)出更好的學(xué)習(xí)和記憶能力,。

圖3 miR155敲除可提高4月齡和8月齡APP/PSEN1小鼠Barnes迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力。a Barnes巴恩斯迷宮模式圖 b,c各組小鼠的潛伏期時(shí)間(s),。

5 miR155敲除對(duì)前額葉皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組的影響

為了研究miR155敲除對(duì)小鼠大腦皮質(zhì)基因表達(dá)的影響,，研究人員選擇了48只4月齡和8月齡6種不同基因型小鼠(WT，APP/PSEN1,，miR155+/-,，miR155-/-，APP/PSEN1,；miR155+/-,，APP/PSEN1；miR155-/-)的前額葉皮質(zhì)(PFC)樣本(n=4/組)進(jìn)行RNA測(cè)序,。

結(jié)果表明,，各組之間的DEG的數(shù)量有很大的差異(圖4a)，與WT小鼠相比,， miR155敲除的WT小鼠大腦皮質(zhì)DEGs中幾個(gè)與真核啟動(dòng)因子,、核糖體和線粒體途徑相關(guān)的基因明顯下調(diào)，以及幾種神經(jīng)退行性疾病的KEGG通路下調(diào),，包括AD,、PD和亨廷頓病（圖4b,，c）,。

圖4 miR155敲除APP/PSEN1小鼠與APP/PSEN1小鼠轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因(DEG)相似性比較。a 48只小鼠的皮質(zhì)DEG情況b miR155-/- vs. WT中鑒定到的前20個(gè)差異最大的基因,，以及c具有代表性的基因集富集,。d,e 4月齡的miR155?/?與WT，APP/PSEN1與WT之間DEG重疊情況,。

6 miR155敲除APP/PSEN1小鼠與APP/PSEN1小鼠轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因(DEG)相似性比較

為了闡明可能的基因調(diào)控,，研究人員比較了各組小鼠的DEG相似性 (圖4a)。4月齡的miR155?/?與WT,， APP/PSEN1與WT之間有296個(gè)DEG重疊,，且在這296個(gè)基因中,，miR155?/?與WT之間DEG的倍數(shù)變化，和APP/PSEN1與WT之間DEG的倍數(shù)變化存在明顯的正相關(guān)(圖4d),。在這些基因中,，與核糖體、蛋白質(zhì)翻譯和翻譯因子相關(guān)的基因強(qiáng)烈下調(diào)(圖4e),。且在上調(diào)和下調(diào)基因中,，CD34+造血干細(xì)胞前體基因集的尤其豐富，這暗示著APP/PSEN1和miR155?/?基因型都會(huì)導(dǎo)致某種形式的蛋白病變,，如APP/PSEN1基因突變會(huì)導(dǎo)致Aβ淀粉樣變性,。

7 miR155缺失與APP代謝之間的相互作用

前文中提到，APP/PSEN1小鼠突觸功能受損,，而miR155的缺失可改善10月齡APP/PSEN1小鼠的突觸功能,，但miR155的缺失卻使WT小鼠突觸功能受損。在不同的小鼠中（一種小鼠有APP的表達(dá),，一種小鼠無）,， miR155的缺失對(duì)突觸功能的作用卻不盡相同。這一有趣的生物學(xué)現(xiàn)象,，吸引著研究人員繼續(xù)探索miR155缺失與APP代謝之間的相互作用,。

4月齡的APP/PSEN1小鼠和APP/PSEN1；miR155?/?小鼠中存在51個(gè)差異表達(dá)基因(圖5a),，8月齡的APP/PSEN1小鼠和APP/PSEN1,；miR155?/?小鼠中存在11個(gè)差異表達(dá)基因，在這些差異基因中,，BTG3在4月齡和8月齡APP/PSEN1,；miR155?/?小鼠中均下調(diào)。對(duì)4月齡小鼠的轉(zhuǎn)錄組51個(gè)差異基因進(jìn)行基因富集分析,，發(fā)現(xiàn)差異基因更多的參與在“神經(jīng)系統(tǒng)生理學(xué)異?！薄ⅰ吧窠?jīng)突起生長(zhǎng)的NCAm信號(hào)”以及“阿爾茨海默病”經(jīng)典代謝通路等生物學(xué)過程(圖5b),。

圖5 miR155缺失與APP代謝之間的相互作用,。a APP/PSEN1小鼠和APP/PSEN1；miR155?/?小鼠的DEG,，和b相關(guān)聯(lián)的基因集富集,。c  miR155在12月齡APP / PSEN1小鼠的DG和EC中的表達(dá),。d APP/PSEN1小鼠海馬DG和EC區(qū)的miR155原位雜交,。e ?根據(jù)CERAD神經(jīng)病理學(xué)評(píng)分得到的平均切片強(qiáng)度的箱線圖

8 miR155在APP/PSEN1小鼠的海馬齒狀回和AD病人的海馬CA1區(qū)上調(diào)

前文提到，miR155缺失可以改善APP/PSEN1小鼠海馬突觸功能,，所以研究人員猜想,，會(huì)不會(huì)miR155在APP/PSEN1小鼠海馬齒狀回中上調(diào)呢,？緊接著，研究人員進(jìn)行了一系列的探索實(shí)驗(yàn),。通過qPCR分析12月齡APP/PSEN1和WT小鼠的齒狀回(DG)和內(nèi)嗅皮層(EC)中miR155的表達(dá),，miR155在DG中上調(diào)，在EC無明顯變化(圖5c),。與EC相比,，DG內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞增生可能是miR155區(qū)域性差異表達(dá)的原因。miR155在APP/PSEN1小鼠海馬中表達(dá)上調(diào),，提示miR155是影響APP/PSEN1小鼠海馬齒狀回突觸功能的調(diào)控分子,。

miR155在AD小鼠海馬區(qū)域上調(diào)，那么在AD病人中又是如何呢,？研究人員對(duì)AD病人和同齡正常人死后CA1海馬組織進(jìn)行原位雜交,，發(fā)現(xiàn)AD病人的平均切片強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(AD病人：n=7，對(duì)照：n=4,，圖5d,，e),說明miR155在AD病人的海馬CA1區(qū)中也上調(diào)。

9 miR155缺失使一類神經(jīng)細(xì)胞亞群中的基因表達(dá)下調(diào),，但這類亞群在大多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者中不存在

為了進(jìn)一步了解miR155的缺失對(duì)哪類細(xì)胞類型影響最大,，研究人員將本研究中檢測(cè)到的DEG與最近一篇文章報(bào)道的48名AD病人和正常人死后腦組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)合起來，比較發(fā)現(xiàn)幾個(gè)差異表達(dá)基因與一系列細(xì)胞亞群標(biāo)記物緊密相關(guān)（圖6a）,。在4月齡的miR155?/?與WT的DEG中,，表征興奮性神經(jīng)元亞群的標(biāo)記基因(ex6和ex11)顯著下調(diào)，而表征星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記基因(Ast3)上調(diào),。這暗示著miR155的缺失與一類神經(jīng)元亞群的丟失有關(guān),，該亞群在健康受試者中存在，但在阿爾茨海默病人中不存在,。

圖6 miR155缺失對(duì)AD分子網(wǎng)絡(luò)的影響,。a 差異表達(dá)基因與細(xì)胞亞群b整合從mSBB，ROS,，mAP和mAYO收集的死后病人的腦轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)DEG情況,。c-f數(shù)量性狀位點(diǎn)表達(dá)（eQTL）分析及AD GWAS風(fēng)險(xiǎn)基因的富集。

10 miR155缺失致AD樣腦轉(zhuǎn)錄改變,，上調(diào)了與阿爾茨海默病相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn) 

miR155缺失在小鼠中引起的轉(zhuǎn)錄變化如何與人類AD患者腦組織中的變化相對(duì)應(yīng),？研究人員將將本研究中檢測(cè)到的DEG數(shù)據(jù)同四個(gè)地區(qū)人類晚發(fā)性AD的六個(gè)大腦區(qū)域RNA序列整合在一起進(jìn)行分析研究。這些數(shù)據(jù)共包括從六個(gè)大腦區(qū)域收集的928個(gè)樣本,，進(jìn)行歸一化處理后,，使用基因富集分析方法檢查了與對(duì)照組相比，AD組的DEG是否集體上調(diào)或下調(diào)(圖6b)。

與WT 小鼠相比,，4月齡miR155?/?小鼠DEG中出現(xiàn)了與AD相關(guān)的轉(zhuǎn)錄改變,。與AD病人的進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在上述DEG中下調(diào)的基因,，在7個(gè)AD病人中有6個(gè)顯著負(fù)富集,，相反，在上述DEG中上調(diào)的基因,，在7個(gè)AD病人中有5個(gè)顯著正富集,。總體而言,，這表明在幾個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集和腦組織環(huán)境中,，miR155缺陷型的AD模型小鼠中與miR155缺失相關(guān)基因的表達(dá)變化，同AD病人的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)一致,。

全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)確定了與AD病理相關(guān)的大量風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn),，通過 GWAS從常見的突變中發(fā)現(xiàn)AD的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)是普遍的研究手段，GWAS發(fā)現(xiàn)的顯著位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系常采用數(shù)量性狀位點(diǎn)表達(dá)（eQTL）來分析 (圖6c-e),。在4個(gè)月齡的miR155?/?與WT和APP/PSEN1與WT的比較中,，上調(diào)的基因與AD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的eQTL的富集程度最高(圖6f)。這表明miR155影響的基因表達(dá)總體上與AD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),，進(jìn)一步支持了miR155的缺失與人類AD疾病的相關(guān)性,。

本文研究了miR155缺失對(duì)4、8和10個(gè)月齡的對(duì)照組(WT)和APP/PSEN1小鼠的學(xué)習(xí)記憶行為,、神經(jīng)病理學(xué)和皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄表型的影響,，發(fā)現(xiàn)miR155敲除的8月齡APP/PSEN1小鼠腦中Aβ沉積增多、突觸功能恢復(fù),，但miR155敲除可提高4月齡和8月齡APP/PSEN1小鼠Barnes迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力,，進(jìn)一步探索了miR155缺失對(duì)前額葉皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組影響，與APP代謝之間的相互作用,。轉(zhuǎn)錄組分析表明,，miR155在APP/PSEN1小鼠的海馬齒狀回和AD病人的海馬CA1區(qū)上調(diào)，作者還整合了來自四個(gè)地區(qū)的AD病人的六個(gè)大腦區(qū)域RNA序列,，發(fā)現(xiàn)miR155缺失致AD樣腦轉(zhuǎn)錄改變,，上調(diào)了與阿爾茨海默病相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)，說明了miR155的失調(diào)與人類晚發(fā)性AD疾病至少在以下4個(gè)領(lǐng)域具有相關(guān)性：(1)天然免疫反應(yīng)途徑,；(2) 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),；(3)突觸病理；(4) β-淀粉樣蛋白沉積,。

本文揭示了miR155對(duì)阿爾茲海默病小鼠及病人的多方面影響,，從實(shí)驗(yàn)開始的對(duì)AD病理學(xué)特征的研究到后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完整、合理,、可靠。本文還利用了全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）這一醫(yī)學(xué)疾病研究的絕佳利器,，巧妙地整合了上百個(gè)阿茲海默癥人腦死亡標(biāo)本的轉(zhuǎn)錄測(cè)序組進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,，該單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)為探尋miR155與阿爾茲海默病相關(guān)性的分子基礎(chǔ)和細(xì)胞基礎(chǔ)提供了一個(gè)藍(lán)圖。

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