寒風(fēng)凜冽,，又到了一年一度寫標(biāo)書的季節(jié),，你開始準(zhǔn)備了么？在分子機(jī)制的研究中,，蛋白和蛋白之間的互作研究可以說是非常經(jīng)典了,，研究蛋白互作的方法有很多，今天我們來介紹九種,。

CoIP其實(shí)就是兩個(gè)蛋白相互的IP（免疫沉淀反應(yīng)）實(shí)驗(yàn),，在已知蛋白B和C之間有相互作用的前提下,，這種前提一般需要有一個(gè)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)或者Pulldown實(shí)驗(yàn)來作為支持。IP就是用來驗(yàn)證蛋白C和蛋白B之間相互作用的,。如果在Agarose珠上的Protean A/G所結(jié)合的抗體,，可以結(jié)合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可檢測(cè)出蛋白C的表達(dá),，反之亦然,，通過這種相互間免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)，就可以明確地驗(yàn)證出,，B與C之間的相互作用了,。

比如這份標(biāo)書：PYK2促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的一個(gè)新的分子機(jī)制研究：結(jié)合并磷酸化E-cadherin？（百度檢索題目可查到全文）

這個(gè)實(shí)驗(yàn)跟免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)很像,，不同的是免疫共沉淀是在細(xì)胞里進(jìn)行的,，在眾多的蛋白里，拉住A蛋白的同時(shí),把B蛋白也給拉出來了,，這還不能證明是直接的結(jié)合,，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B,，這樣拉住A蛋白的同時(shí)也能把B蛋白也給拉出來,。要證明直接的結(jié)合就是Pull-down實(shí)驗(yàn)。提純所要研究的兩個(gè)蛋白（一般是在BL21等菌種表達(dá)提純）,，這兩個(gè)蛋白帶上不同的標(biāo)簽（提純蛋白一般帶GST或者HIIS標(biāo)簽）,，然后將他們放在同一個(gè)體系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一個(gè)蛋白拉下來,，用WB檢測(cè)另一個(gè)蛋白的存在,。

比如這份標(biāo)書：惡性腫瘤的發(fā)生,、發(fā)展的細(xì)胞表觀遺傳學(xué)機(jī)制,。（同樣可以百度檢索到全文）

將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法,。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位,。兩種不同的蛋白使用不同屬性的不同顏色熒光標(biāo)記后,，通過觀察顏色的變化確定是否有共定位，也可以使用軟件進(jìn)行分析,。應(yīng)用策略：該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng),、敏感性高、速度快,。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決,，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜,。

比如這份標(biāo)書：惡性腫瘤的發(fā)生,、發(fā)展的細(xì)胞表觀遺傳學(xué)機(jī)制。（同上,，可以百度檢索到全文）

熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊,，并且兩個(gè)分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時(shí),，就會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象,，使得供體的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多（熒光猝滅）,，而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)（敏化熒光）,。

青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）為目前蛋白-蛋白相互作用研究中最廣泛應(yīng)用的FRET對(duì),。CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜相重疊,。將供體蛋白CFG和受體蛋白YFG分別與兩種目的蛋白融合表達(dá)。當(dāng)兩個(gè)融合蛋白之間的距離在5-10nm的范圍內(nèi),，則供體CFP發(fā)出的熒光可被YFP吸收,，并激發(fā)YFP發(fā)出黃色熒光，此時(shí)通過測(cè)量CFP熒光強(qiáng)度的損失量來確定這兩個(gè)蛋白是否相互作用,。兩個(gè)蛋白距離越近,，CFP所發(fā)出的熒光被YFP接收的量就越多，檢測(cè)器所接收到的熒光就越少,。

比如這份標(biāo)書：重大心血管疾病相關(guān)GPCR新藥物靶點(diǎn)的基礎(chǔ)研究（百度可以找到這份標(biāo)書）

Duolink采用PLA專業(yè)技術(shù)，通過一抗,、二抗,、RCA滾環(huán)復(fù)制來放大熒光信號(hào)。proximity ligation assay(鄰位連接技術(shù),PLA)：一種高靈敏度的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù),。Duolink技術(shù)可以得到很高的分辨率和特異性,，可以更清晰的、定量的研究蛋白-蛋白相互作用,、蛋白的磷酸化水平,、蛋白的定量等。這種方法可以檢測(cè)到較弱的結(jié)合,，如果上面的幾種方法做不出來的話,，可以考慮這個(gè)方法，不過試劑盒是比較貴的,。

目前還沒有檢索到標(biāo)書里有寫到的,，標(biāo)書里提到的蛋白的相關(guān)作用的研究方法以前面四種為主。

這是在活細(xì)胞中觀察蛋白相互作用的很好的方法,。這個(gè)方法還是存在假陽性的，細(xì)胞里大量表達(dá)的分段的YFP可能會(huì)不受研究蛋白的結(jié)合與否而自己結(jié)合在一起,，所以陰性對(duì)照的使用非常重要,。并且YFP兩段結(jié)合在一起后，基本是不可逆的,，小分子或其他抑制劑很難使結(jié)合的蛋白分開,，在建模的時(shí)候要考慮到這個(gè)因素。

此方法與BIFC的最大區(qū)別在于,，BIFC拆分的是YFP熒光蛋白,，NanoBiT拆分的是螢光素酶-NanoLuc? Luciferase，由于NanoLuc分子量小,，光信號(hào)強(qiáng),，表達(dá)效率高，非特異性自發(fā)光背景低,，并且標(biāo)簽蛋白結(jié)合是可逆的,，所以這個(gè)方法較BIFC有很多優(yōu)勢(shì)。但是,，它需要配對(duì)的底物,，并且這個(gè)底物還不便宜，需要大量使用的話要考慮好經(jīng)濟(jì)問題,。

這個(gè)方法與FRET相比，不需要激發(fā)光,，背景更低,；不需要漂白，細(xì)胞損壞更少,；同時(shí)也避免了自發(fā)熒光干擾,；作為供體的NanoLuc螢光素酶蛋白分子量小，更適合融合蛋白表達(dá)構(gòu)建,，并且光信號(hào)強(qiáng)。但是,，它需要配對(duì)的底物,，并且這個(gè)底物還不便宜，需要大量使用的話要考慮好經(jīng)濟(jì)問題,。

SNAP或CLIP的熒光染料標(biāo)記的底物不能進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)部不會(huì)有信號(hào)產(chǎn)生而對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾,；同時(shí)也只能研究蛋白表面的蛋白結(jié)合,。因?yàn)闊晒馊玖鲜峭饨拥模詴?huì)比內(nèi)源表達(dá)的光強(qiáng)要強(qiáng),。均相檢測(cè),，可用于高通量篩選。

好了,，今天就介紹到這里,，對(duì)于醫(yī)生朋友來說，熟練掌握前4種方法,，包括原理和protcol,，寫標(biāo)書應(yīng)該夠了,，如果大家想寫后面幾種也是可以的，有興趣的可以了解一下這些方法的原理,。

最后祝愿大家,，寫標(biāo)書快樂，寫標(biāo)書不開心也是一天,，開心也是一點(diǎn),，不如.....不寫了吧。