“時勢造英雄”,，用來形容近幾年的mRNA技術(shù)真是非常合適,。基于mRNA技術(shù)研發(fā)的個體化癌癥疫苗,，此前就讓學(xué)界翹首以待,，而技術(shù)手段的進(jìn)步，更是讓圍繞mRNA的更多療法成為可能,。

近期,，哈佛大學(xué)和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院的專家們就在《自然評論·癌癥》（Nature Reviews Cancer）共同撰文，深度解讀了當(dāng)前基于mRNA的抗癌療法發(fā)展現(xiàn)狀,，技術(shù)特點(diǎn)與未來發(fā)展前景,，這又是一篇不容錯過的好文章[1]！浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院孔娜研究員是本文的通訊作者之一,。

論文首頁截圖

前言

制約mRNA用于臨床治療的挑戰(zhàn),，主要是mRNA本身不穩(wěn)定且存在免疫原性，但納米技術(shù)的進(jìn)展，特別是脂質(zhì)納米顆粒的出現(xiàn),，才真正使基于mRNA的抗癌療法成為可能,。總體而言,，基于mRNA的抗癌療法有一個共同原理,，即：mRNA被成功翻譯為蛋白質(zhì)，以抑制腫瘤生長或誘導(dǎo)/加強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答,。

例如以mRNA直接編碼抑癌蛋白,，或在癌細(xì)胞內(nèi)部/腫瘤微環(huán)境中編碼可激活免疫應(yīng)答的腫瘤新抗原、細(xì)胞因子,，又或是干擾調(diào)控癌細(xì)胞存活的關(guān)鍵基因表達(dá),，乃至以mRNA技術(shù)進(jìn)一步強(qiáng)化CAR-T療法/TCR-T療法等等，都是有可行性的思路,。

此外,，科研和產(chǎn)業(yè)界還在探索新型mRNA，如自擴(kuò)增mRNA（saRNA）,、反式擴(kuò)增mRNA（taRNA）,、環(huán)狀mRNA（circRNA）的設(shè)計和應(yīng)用,，以及mRNA納米微粒長期保存手段,、給藥途徑和器官選擇性的精準(zhǔn)翻譯等課題，這些探索將有望使基于mRNA的抗癌療法更進(jìn)一步,，真正覆蓋各種類型癌癥,、造福廣大患者群體。

mRNA的種類和遞送平臺

體外人工合成的經(jīng)典mRNA與真核細(xì)胞內(nèi)的mRNA結(jié)構(gòu)相似,，且易于調(diào)整,、合成簡便、可大量制備,，而不需進(jìn)入細(xì)胞核也能規(guī)避影響遺傳物質(zhì)的風(fēng)險,，但在設(shè)計上降低免疫原性和不穩(wěn)定性、提升蛋白質(zhì)表達(dá)效率則尤為重要,。

例如從結(jié)構(gòu)優(yōu)化的角度而言,，可借助自體或合成類似物，對mRNA的5’端帽子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,，提高mRNA的穩(wěn)定性,、轉(zhuǎn)錄效率和激活免疫應(yīng)答的能力，其它優(yōu)化還有對5’端或3’端非翻譯區(qū)（ORT）的化學(xué)或序列優(yōu)化,，對開放閱讀框架（ORF）區(qū)的密碼子優(yōu)化,，將3’端Poly(A)尾的長度控制在120-150個核苷酸等等等等。

人工合成常規(guī)mRNA結(jié)構(gòu)及優(yōu)化的可行性

不過經(jīng)典形態(tài)的mRNA也有一些問題難以克服，如在翻譯開始后容易降解,，因此或需多次給藥以維持理想的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,，可能引發(fā)副作用乃至“脫靶效應(yīng)”，探索saRNA等新型mRNA就是為解決這些問題,，新型mRNA往往有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和更高的蛋白質(zhì)表達(dá)效率,，乃至獨(dú)特的調(diào)節(jié)作用和制備使用優(yōu)勢。

例如saRNA除可表達(dá)目標(biāo)蛋白外,，其ORF區(qū)域的非結(jié)構(gòu)基因nsP1-4還可攜帶表達(dá)RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）的序列,，作為亞基因組啟動子，使RdRP以saRNA為模板產(chǎn)生更多拷貝,，這讓saRNA的蛋白表達(dá)持續(xù)時間比經(jīng)典mRNA更長,；而taRNA則有制備簡便和安全的優(yōu)勢，circRNA的獨(dú)特結(jié)構(gòu)則是一把“雙刃劍”,。

探索中的新型mRNA結(jié)構(gòu)

病毒以外的mRNA載體

病毒載體是當(dāng)前避免mRNA在體液內(nèi)被快速降解的主要手段,，但人體對相應(yīng)病毒的既往免疫和新誘導(dǎo)免疫，也可能導(dǎo)致mRNA療法效率低下,，因此非病毒性的mRNA封裝材料或是更優(yōu)解,，例如mRNA疫苗廣泛使用的各種脂質(zhì)載體，以及陽離子聚合物（polycations）等等,，一些載體還可通過“佐劑效應(yīng)”增強(qiáng)免疫應(yīng)答,。

編碼腫瘤抗原的mRNA

基于癌癥特點(diǎn)編碼特異性抗原，并順利被免疫細(xì)胞識別以激活免疫應(yīng)答,，是mRNA癌癥疫苗的核心作用機(jī)制,，而mRNA疫苗可編碼的抗原也有分類，即腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）和腫瘤特異性抗原（TSAs）,，需要分別進(jìn)行敘述和討論,。

TAAs-mRNA疫苗

TAAs在癌癥治療中的應(yīng)用相對更廣泛，其特點(diǎn)是在癌細(xì)胞表面高表達(dá),，但也在正常組織中表達(dá),，腫瘤特異性和免疫原性較弱，且機(jī)體普遍對單一TAA高度耐受,，因此癌癥疫苗大多采用“TAAs組合”以增強(qiáng)療效,。

目前已進(jìn)入臨床研究階段的樹突狀細(xì)胞mRNA疫苗，大多就同時編碼了多個TAAs,，還有在研疫苗嘗試編碼從腫瘤組織和腫瘤干細(xì)胞中提取的腫瘤全RNA組,，以略過TAAs選擇并激活強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答，聯(lián)合化療,、免疫治療等手段還有望進(jìn)一步提升療效,，已有大量臨床早期研究在探索聯(lián)合治療的可行性。

不過樹突狀細(xì)胞mRNA疫苗的制備復(fù)雜、花費(fèi)較高,，因此近年來的mRNA癌癥疫苗也逐漸轉(zhuǎn)向使用脂質(zhì)納米微粒（LNP）等合成載體,，例如知名的Lipo-MERIT疫苗平臺就將mRNA與陽離子脂質(zhì)絡(luò)合，靶向脾臟中的樹突狀細(xì)胞以激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答,，基于該平臺的BNT111等疫苗已在挑戰(zhàn)關(guān)鍵III期臨床研究,。

編碼TAAs的mRNA癌癥疫苗作用機(jī)制示意圖

TSAs-mRNA疫苗

TSAs即“腫瘤新抗原”，在定義上只對應(yīng)癌細(xì)胞的基因突變,，因此理論上不會被免疫耐受所束縛,，且不同腫瘤的突變譜差異為定制高度個體化癌癥疫苗提供了可能。編碼TSAs的mRNA癌癥疫苗,，設(shè)計上仍采用上文提到的LNP和病毒載體兩條路線,，可同時編碼數(shù)十個TSAs，但制備較為繁瑣且價格高昂,。

以mRNA編碼細(xì)胞因子

細(xì)胞因子對腫瘤微環(huán)境有顯著的調(diào)節(jié)作用,，但采用類似系統(tǒng)性化療的方法注射細(xì)胞因子只會“事倍功半”，療效,、安全性和給藥方式等多方面表現(xiàn)都不盡人意,，但mRNA技術(shù)有望解決制約傳統(tǒng)細(xì)胞因子療法的一系列瓶頸，如半衰期較短,、無法將給藥范圍局限于腫瘤微環(huán)境局部,、制備繁瑣且耗時長等等。

目前被重點(diǎn)探索用于mRNA療法的細(xì)胞因子有IL-2,、IL-12和干擾素-α等,，瘤內(nèi)注射由LNP封裝的相應(yīng)編碼mRNA,，可在動物實(shí)驗中有效激活免疫應(yīng)答,。而與mRNA疫苗類似，同時混用多種細(xì)胞因子的mRNA,，可激活更廣泛的免疫應(yīng)答,，如IL-23/IL-36/OX40L-mRNA組合療法就在臨床前研究中表現(xiàn)出色[2]。

以mRNA編碼關(guān)鍵細(xì)胞因子調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答的目標(biāo)

以mRNA編碼抑癌蛋白

利用納米微粒等載體遞送編碼p53,、PTEN等關(guān)鍵抑癌蛋白的mRNA,，有望快速、大幅提高抑癌蛋白表達(dá)水平以有效抗癌,，如2019年本文作者團(tuán)隊開展的一項研究,，即初步驗證了瘤內(nèi)注射TP53 mRNA納米微粒的可行性，該療法對肝癌和非小細(xì)胞肺癌有抗腫瘤活性,，還有望增敏現(xiàn)有抗癌藥物（依維莫司）[3],。

抑癌蛋白不僅本身有重要生理功能，還對腫瘤微環(huán)境有顯著調(diào)節(jié)作用，撰寫本次綜述的哈佛團(tuán)隊已開展研究證實(shí)：編碼p53的mRNA與PD-1抑制劑聯(lián)合使用可協(xié)同增效[4],，這將是未來值得深入探索的“免疫Combo”之一,。

以mRNA編碼抑癌蛋白，雙管齊下抗癌

以mRNA編碼Cas9用于基因編輯

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)不僅是科研利器,，也有望成為抗癌大殺器,，但其起效的關(guān)鍵是小向?qū)NA（sgRNA）和Cas9成功被遞送到靶細(xì)胞內(nèi)，而mRNA技術(shù)可助力Cas9的遞送,，且Cas9 mRNA可顯著減少脫靶效應(yīng)和基因毒性,。

2020年中美兩國學(xué)者共同開發(fā)的選擇性器官靶向脂質(zhì)納米顆粒（SORT-LNP）技術(shù)，則突破了傳統(tǒng)病毒載體的局限性,，使編碼Cas9的mRNA能夠被成功遞送到肝臟以外的器官起效[5],，基因編輯效率也較好?；赟ORT-LNP平臺開發(fā)的mRNA藥物已在2023年完成臨床I期研究首例給藥,，預(yù)計也將很快正式進(jìn)軍抗癌治療。

此外,，還有研究嘗試在脂質(zhì)納米顆粒里同時封裝Cas9 mRNA和sgRNA,，使用于卵巢癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤時的基因編輯效率提升到了70-80%，后續(xù)研究則在此基礎(chǔ)上,，進(jìn)一步封裝了關(guān)鍵基因的小干擾RNA（siRNA）來繼續(xù)增效[6],。

以mRNA編碼Cas9介導(dǎo)基因編輯，助力抗癌治療

以mRNA編碼CAR或TCR

CAR-T或TCR-T細(xì)胞療法的體外改造過程,，往往需要以逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體,，將CAR/TCR序列插入患者T細(xì)胞基因組，但轉(zhuǎn)染存在誘發(fā)基因突變的風(fēng)險,，而mRNA技術(shù)可有效降低風(fēng)險并提高轉(zhuǎn)染率,，如mRNA電穿孔技術(shù)導(dǎo)入CAR已成為科研探索的首選，該方法可使CAR在T細(xì)胞表面短暫表達(dá)約1周,。

以mRNA誘導(dǎo)CAR/TCR的短時間內(nèi)表達(dá),，可避免CAR/TCR存在時間過長引發(fā)的風(fēng)險，還可同時遞送其它免疫活性物質(zhì)以實(shí)現(xiàn)協(xié)同增效,，但缺點(diǎn)在于需重復(fù)多次給藥,，為此需繼續(xù)優(yōu)化mRNA結(jié)構(gòu)以提升其穩(wěn)定性和翻譯效率。

當(dāng)前已有多種借助mRNA技術(shù)的CAR-T療法進(jìn)入臨床早期研究,，但mRNA技術(shù)可能有著更大的意義：注射精準(zhǔn)靶向T細(xì)胞,、且編碼CAR/TCR的mRNA-LNP，如能在體內(nèi)對T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)重編程,，并產(chǎn)生可持續(xù)擴(kuò)增的CAR-T/TCR-T細(xì)胞,，就有望解決當(dāng)前過繼性療法個體化制備的許多難題,，但探索還只是剛剛起步而已。

以mRNA編碼CAR或TCR

結(jié)語及未來

mRNA技術(shù)必將在未來參與到各種疾病的治療之中,，而癌癥很有可能就是第一個關(guān)鍵戰(zhàn)場,，為此mRNA技術(shù)和相關(guān)療法的開發(fā)，需要繼續(xù)破解多個難題：

1.設(shè)計mRNA疫苗時應(yīng)選擇更合適和有效的腫瘤抗原,，為此需有效識別和篩選新抗原,，制備疫苗也必須更快速和廉價，高通量基因測序和數(shù)據(jù)分析提升將是關(guān)鍵,；

2.為突破mRNA的遞送瓶頸,，如僅能遞送到肝臟等納米微粒的常見靶器官，藥物遞送平臺需要全面拓展升級,，未來研究可考慮借助“遺傳條形碼”追蹤mRNA在體內(nèi)的遞送流程和特點(diǎn),，分析突破體內(nèi)關(guān)鍵屏障的需求，也可考慮外泌體遞送或張峰團(tuán)隊開發(fā)的SEND系統(tǒng)[7]等選項,；

3.mRNA療法的給藥方式可參考mRNA疫苗嘗試創(chuàng)新,，如采用口服、可溶性微針貼片或吸入式凝膠等,，提升對特定部位的給藥效率,；

4.繼續(xù)探索新型mRNA即saRNA、taRNA和circRNA等的應(yīng)用,，解決延長mRNA翻譯產(chǎn)物持續(xù)存留時間的關(guān)鍵問題,，并積極嘗試與現(xiàn)有免疫治療的聯(lián)合；

5.由于Cas9 mRNA長度遠(yuǎn)超常規(guī)mRNA,，給封裝帶來了很大挑戰(zhàn),，未來可能需轉(zhuǎn)向封裝編碼基因編輯工具蛋白，如IscB,、IsrB的mRNA,。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu C, Shi Q, Huang X, et al. mRNA-based cancer therapeutics[J]. Nature Reviews Cancer, 2023.

[2]Hewitt S L, Bai A, Bailey D, et al. Durable anticancer immunity from intratumoral administration of IL-23, IL-36γ, and OX40L mRNAs[J]. Science Translational Medicine, 2019, 11(477): eaat9143.

[3]Kong N, Tao W, Ling X, et al. Synthetic mRNA nanoparticle-mediated restoration of p53 tumor suppressor sensitizes p53-deficient cancers to mTOR inhibition[J]. Science Translational Medicine, 2019, 11(523): eaaw1565.

[4]Xiao Y, Chen J, Zhou H, et al. Combining p53 mRNA nanotherapy with immune checkpoint blockade reprograms the immune microenvironment for effective cancer therapy[J]. Nature Communications, 2022, 13: 758.

[5]Cheng Q, Wei T, Farbiak L, et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing[J]. Nature Nanotechnology, 2020, 15(4): 313-320.

[6]Zhang D, Wang G, Yu X, et al. Enhancing CRISPR/Cas gene editing through modulating cellular mechanical properties for cancer therapy[J]. Nature Nanotechnology, 2022, 17(7): 777-787