見(jiàn)圖一

基于RNA-seq表征CTC,，原發(fā)腫瘤和HCC細(xì)胞系之間的差異基因表達(dá),。

圖一

a CTC分離和單細(xì)胞RNA制備工作流程概述。

b 用CD45,、EpCAM和CK抗體標(biāo)記的CTC和WBC的代表性熒光圖像;比例尺為 10 μm,。

c 45種EpCAM和/或泛CK和CD<>的CNV分析++?來(lái)自六名患者的CTC和兩個(gè)CD45 WBC。顯示測(cè)序的CTC和WBC的熒光圖像,。

d t-SNE 圖說(shuō)明了 CTC,、原發(fā)性腫瘤和 HCC 細(xì)胞系之間表達(dá)譜的相似性。

e 與原發(fā)性腫瘤相比,，CTC 中上調(diào)基因的 Hallmark 數(shù)據(jù)集中的通路富集,。超幾何檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)DEG是否與基因集重疊。對(duì)多重假設(shè)檢驗(yàn)進(jìn)行了Benjamini-Hochberg FDR控制方法,。

見(jiàn)圖二

CTC的空間轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性,。

圖二

來(lái)自十名患者的CTC的t-SNE圖揭示了其患者間異質(zhì)性。b Pearson相關(guān)分析顯示從患者P9（上圖）和五名患者組合（下圖）的四個(gè)血管部位抽取的CTC的細(xì)胞間變異性,。

使用雙側(cè)威爾科克斯試驗(yàn),。數(shù)據(jù)使用箱須圖（中位數(shù)、下四分位數(shù),、上四分位數(shù),、最小值和最大值）表示。n = 45 個(gè)細(xì)胞在 HV 中;n = PA中的12個(gè)細(xì)胞;PV 中的 n = 40 個(gè)電池;n = PoV 中的 16 個(gè)單元格,。

P < 0.01,， P < 0.001。上圖中的精確 P 值：高壓與 PA,，P = 1.18 × 10?9;PA 與光伏,，P = 2.79 × 10?4;高壓與光伏，P = 2.36 × 10?4.下圖中的精確 P 值：高壓與 PA,，P = 2.32 × 10?3;PA 與光伏,，P = 7.00 × 10?4;PV vs PoV，P = 1.50 × 10?5;高壓與 PoV,，P = 6.13 × 10?3.條形 = 中位數(shù),，箱形圖 = 四分位數(shù)。c 患者P9中CTC的假時(shí)間動(dòng)力學(xué),。

d 氣泡圖顯示了來(lái)自每個(gè)血管部位富含CTC的分子途徑,。超幾何檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)DEG是否與基因集重疊。對(duì)多重假設(shè)檢驗(yàn)進(jìn)行了Benjamini-Hochberg FDR控制方法,。

見(jiàn)圖三

單CTC轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)力學(xué)突出了循環(huán)過(guò)程中應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞周期異質(zhì)性的途徑改變,。

圖三

a 相鄰血管部位（HV vs PA、PA vs PV 和 PV vs PoV）之間差異表達(dá)基因的動(dòng)態(tài)變化和熱圖,，左圖顯示了差異表達(dá)基因的數(shù)量,，主要信號(hào)通路豐富（右圖）,。

b 來(lái)自HV與PA的CTC的GSEA針對(duì)MYC靶向v1途徑。

c 來(lái)自PA與PV的缺氧途徑的CTC的GSEA,。

d 散點(diǎn)圖，表示不同血管區(qū)室中基于G1/S（x軸）和G2/M（y軸）基因集的單個(gè)CTC的細(xì)胞周期狀態(tài),。

e 盒狀和晶須圖顯示四個(gè)血管部位的 CTC 中 EMT 相關(guān),、血小板活化和趨化因子基因的表達(dá)方差。數(shù)據(jù)以中位數(shù),、下四分位數(shù),、上四分位數(shù)、最小值和最大值表示,。n = 45 個(gè)細(xì)胞在 HV 中;n = PA中的12個(gè)細(xì)胞;PV 中的 n = 40 個(gè)電池;n = PoV 中的 16 個(gè)單元格,。使用雙側(cè)威爾科克斯試驗(yàn)。

見(jiàn)圖四

CCL5 CTC與肝細(xì)胞癌患者循環(huán)的Treg和預(yù)測(cè)的術(shù)后復(fù)發(fā)呈正相關(guān),。

圖四

a 由CTC和原發(fā)性腫瘤差異表達(dá)的免疫逃避相關(guān)基因和細(xì)胞因子,。

b 多重免疫熒光圖像顯示原發(fā)性腫瘤中CCL5的表達(dá)和腫瘤周圍微血管系統(tǒng)中檢測(cè)到的CTC。mVI,，微血管浸潤(rùn),。比例尺分別代表 20 μm、200 μm 和 5 μm,。

c 多重免疫熒光圖像代表在腫瘤周圍微血管系統(tǒng)中檢測(cè)到的CCL5 CTC和CCR5 / FoxP3 Treg之間的空間關(guān)系,。比例尺分別代表 200 μm 和 10 μm。

d 散點(diǎn)圖顯示CCL5 CTC的數(shù)量與CCR5 Treg（CD4,，CD25++++++高和 CD127低HCC外周血CD4 T細(xì)胞中的上部（上部）和總Tregs（下部）（n = 27例患者）,。

e Kaplan-Meier 分析顯示 Treg 患者早期復(fù)發(fā)的可能性增加（左）和總生存率降低（右）+高/反恐委員會(huì)高在外周血與其他組中。

I：特雷格低/CCL5 CTC+低,，II：特雷格低/CCL5 CTC+高,，III：Treg高/CCL5 CTC+低和 IV：Treg高/CCL5 CTC+高.每組有風(fēng)險(xiǎn)的患者數(shù)量列在卡普蘭-邁爾曲線下方。采用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)（d）,。進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)以估計(jì)預(yù)后意義（e）,。

見(jiàn)圖五

CTC通過(guò)CCL5表達(dá)募集Tregs，以產(chǎn)生免疫抑制和促腫瘤的微環(huán)境,。

圖五

a CCL5在具有不同轉(zhuǎn)移潛力的HCC細(xì)胞系中的表達(dá),。

b 與Huh7或MHCC97H細(xì)胞上清液培養(yǎng)基共培養(yǎng)的遷移Treg的數(shù)量，未經(jīng)處理（左圖）,，并用抗人CCL5中和抗體或IgG處理（右圖）,。

c 直方圖顯示CCL5在CCL1敲低或?qū)φ战M的Hepa6-5細(xì)胞中CCL5的相對(duì)mRNA表達(dá)。

d CCL1敲低或?qū)φ战MHepa6-5細(xì)胞中CCL10表達(dá)的免疫熒光圖像,。比例尺為5μm,。

e 注射后血液中的CTC清除率曲線 10 × <>6將Hepa1-6細(xì)胞放入C57BL / 6J小鼠的尾靜脈（每種條件n = 30,，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)五只小鼠）。

f 直方圖顯示CCL5敲低組（n = 5）和載體對(duì)照組（n = 5）小鼠中循環(huán)Treg的百分比,。

g 散點(diǎn)圖,，顯示在e（每組n = 5）中所述條件下發(fā)生的肺（上）和肝轉(zhuǎn)移（下）的數(shù)量。

h 直方圖顯示 e 所述條件下肝轉(zhuǎn)移瘤中 Treg（上）和顆粒酶 B 細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞（下）的數(shù)量,。為每只小鼠選擇一個(gè)肝轉(zhuǎn)移腫瘤選擇代表最密集淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的五個(gè)獨(dú)立的微觀視野,。

i 小鼠Treg向從載體和shCCL5 Hepa1-6原位模型分離的CTC的遷移比較。將CCL5中和抗體添加到共培養(yǎng)系統(tǒng)中以確定對(duì)Treg遷移的影響（每組n = 5）,。比較通過(guò)雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算,。數(shù)據(jù)是三個(gè)（b，c）和五個(gè)（e-g,，i）生物重復(fù)的平均SD±,，并且代表兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。表示 P < 0.001,。e中12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的確切P值：載體+ IgG vs shCCL5 + IgG,，P = 3.49 × 10+?9;載體 + IgG vs 載體 + 抗 CD25ab，P = 1.84 × 10?9,。

見(jiàn)圖六

CCL5誘導(dǎo)通過(guò)p38-MAX途徑介導(dǎo),。

圖六

a 散點(diǎn)圖顯示CCL5和MAX之間在基于scRNA-seq的CTC中表達(dá)的高度相關(guān)性。采用雙尾皮爾遜相關(guān)檢驗(yàn),。

b ChIP 測(cè)定顯示 MAX 與 MHCC5H 細(xì)胞中的 CCL97 基因啟動(dòng)子直接結(jié)合,，使用 IgG 作為陰性對(duì)照。

c 分別用 MAX siRNA 和載體轉(zhuǎn)染 MHCC5H 細(xì)胞中 MAX 和 CCL97 在 mRNA（左）和蛋白質(zhì)水平（右）的相對(duì)表達(dá),，并用 p38 抑制劑 SB203580 或 DMSO 對(duì)照處理 d,。

e 尾靜脈注射后不同時(shí)間點(diǎn)microCT檢測(cè)到的肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量和代表性圖像（綠色轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)）為5×106在C1BL / 6J小鼠中具有三種不同條件的Hepa57-6細(xì)胞（每組n = 5，上圖）,。

f 直方圖顯示治療小鼠肺轉(zhuǎn)移中Tregs（左）和顆粒酶B細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（右）的數(shù)量,，如e中所述。為每只小鼠一個(gè)肺轉(zhuǎn)移腫瘤選擇代表最密集淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的五個(gè)獨(dú)立的微觀視野,。

g 比較有或沒(méi)有Tregs共培養(yǎng)的Huh1細(xì)胞培養(yǎng)基中Treg衍生細(xì)胞因子的水平,，包括TGF-β10，IL-35,，IL-7,，VEGF和TNF-α：誤差線。

h 分別用TGF-β5,、MAX siRNA,、P97抑制劑和DMSO處理的MHCC1H細(xì)胞中MAX和CCL38的mRNA（上）和蛋白質(zhì)（下）水平。

i 免疫逃逸機(jī)制示意圖，CTC通過(guò)TGF-β1-p38-MAX-CCL5信號(hào)傳導(dǎo)的正反饋環(huán)獲得招募免疫抑制Treg細(xì)胞的能力,，從而促進(jìn)在血流和二級(jí)器官中形成有利于轉(zhuǎn)移的微環(huán)境,。比較通過(guò)雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)（c-h）計(jì)算。數(shù)據(jù)是三個(gè)生物（c,，d,，g，h）和五個(gè)生物學(xué)（e）重復(fù)的平均±SD,，并且代表兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn),。表示 P < 0.001。用于比較 c 中 MAX 表達(dá)式的確切 P 值：向量與 siMAX#1,，P = 2.00 × 10 +?6;向量 vs siMAX#2， P = 8.96 × 10?4.c：向量與siMAX#5中CCL1表達(dá)比較的確切P值,，P = 8.00×10 ?6;向量 vs siMAX#2,， P = 1.51 × 10?4.e：向量與shCCL5中5周時(shí)間點(diǎn)的確切P值，P = 2.8 ×10?4;向量 vs shMAX,， P = 1.1 × 10?4.用于比較 MAX 表達(dá)的確切 P 值：DMSO 與 TGF-β1,，P = 2.00 × 10 ?6;DMSO vs TGF-β1 + siMAX#1， P = 8.00 × 10?6;DMSO 與 TGF-β1 + SB203580,，P = 5.00 × 10?5.用于比較 h：DMSO 與 TGF-β5 中 CCL1 表達(dá)的確切 P 值,，P = 2.00 × 10 ?6;DMSO vs TGF-β1 + siMAX#1， P = 5.00 × 10?6;DMSO 與 TGF-β1 + SB203580,，P = 1.8 × 10?5,。

好了，今天的文獻(xiàn)解讀就到這兒來(lái),，我們下期再見(jiàn),！